.svg)
Импульсные электромагнитные поля низкой интенсивности и частоты выборочно снижают жизнеспособность раковых клеток молочной железы
Сара Крочетти , 1, 2 Кристиан Бейер , 3 Грит Шаде , 4 Марсель Эгли , 5 Юрг Фрёлих , 3 и Альфредо Франко-Обрегон 2, 6, *
Вступление
Растет интерес к использованию электромагнитных полей в качестве противоопухолевого лечения [1] — [5] . Поиск новых терапевтических стратегий особенно активен в области онкологии, где стандартные противоопухолевые методы лечения, основанные на химиотерапевтических препаратах и / или лучевой терапии, обладают потенциально пагубными вторичными эффектами и сами по себе часто не обеспечивают полного и стойкого выздоровления. Этот недавний интерес подогревается тем фактом, что импульсные электромагнитные поля крайне низкой частоты и малой интенсивности (PEMF) оказались безвредными, возможно, даже полезными [4] , [6] — [7], к нормальным типам клеток. С другой стороны, было показано, что некоторые классы злокачественных клеток особенно уязвимы к их воздействию [5] , [8] — [10] . Потенциальная ценность чрезвычайно низкочастотных PEMF, следовательно, заключается в их использовании в качестве адъювантного лечения по сравнению с более традиционными химио- и радиотерапевтическими методами с целью снижения их дозировки, смягчения любых вредных вторичных побочных эффектов и улучшения прогноза пациента. Однако, несмотря на недавние успехи, типы применяемых сигналов и проверенных классов рака широко варьировались, обеспечивая широкий диапазон эффективности уничтожения и преуспев в предотвращении совпадений в этой области исследований [1] , [3] — [5]. Прежде чем их можно будет использовать для выборочного удаления раковых клеток из гетерогенной популяции злокачественных и здоровых клеток, потребуется четкое определение типов рака, наиболее восприимчивых к PEMF, и их последующая оптимизация для целенаправленного уничтожения.
Здесь мы показываем, что способность PEMF сверхнизкой интенсивности и частоты избирательно убивать клетки рака молочной железы в значительной степени зависит от параметров поля. Клетки рака молочной железы MCF-7 избирательно уязвимы для PEMF в пределах дискретного окна параметров сигнала PEMF и времени воздействия с разрешением mTeslas и десятки минут соответственно. Используя пять независимых средств мониторинга гибели раковых клеток, мы получили идентичные результаты; селективное уничтожение клеток MCF7 лучше всего достигалось с PEMF величиной от пика до пика 3 мТл, при частоте импульсов 20 Гц и продолжительности воздействия всего 60 минут в день. Напротив, та же самая парадигма пульсации (цитотоксичность для MCF-7) была безвредной для нормальных клеток молочной железы MCF-10.
Материалы и методы
Сотовые линии
Клетки аденокарциномы человека MCF7 и неканцерогенные клетки человека MCF10 были предоставлены ATCC (Манассас, Вирджиния, США). Клетки MCF7 выращивали в D-MEM (Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (10%) (Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство), L-глутамина (1%) ( Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство) и пенициллин-стрептомицин (1%) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Клетки MCF10 культивировали в D-MEM / F12 (Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство) с добавлением фетальной телячьей сыворотки (5%) (Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство), EGF (0,02%) ( Пепротек, Нью-Джерси, США), гидрокортизон (0,05%) (Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США), инсулин (0,1%) (Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США). США) и пенициллин-стрептомицин (1%) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Клетки поддерживали при 37 ° C в стандартном инкубаторе для культур тканей (Vitaris AG, Баар, Швейцария) в атмосфере с влажностью 95% и 5% CO.2 .
Система экспонирования PEMFs
Установка воздействия PEMF, описанная в тексте S1 и проиллюстрированная на рисунке S1 AC , была размещена внутри стандартного инкубатора для культивирования клеток (Vitaris AG, Баар, Швейцария), обеспечивающего влажную среду при 37 ° C, но не регулирующего CO 2 . Ячейки подвергались воздействию асимметричного импульсного магнитного поля при непрерывном мониторинге напряженности поля и температуры. Необлученные (контрольные) клетки помещали в один и тот же инкубатор на одинаковые периоды времени, но были защищены от магнитных полей металлической оболочкой из мю-металла, окружающей катушки. Таким образом, все камеры подвергались воздействию одного и того же климата и температуры.
PEMFs лечение
Клетки MCF7 и MCF10 высевали в колбы T25 (SPL Life Sciences, Корея) в концентрациях 6,5 × 10 5 клеток / мл и 6,7 × 10 5.клеток / мл соответственно. Через 24 часа после посева клетки промывали PBS (Life Technologies Corporation, Гибко, Пейсли, Соединенное Королевство), давали свежую среду и подвергали воздействию PEMF для первого из трех ежедневных испытаний; СМИ не менялись с этого момента. Применяли асимметричное импульсное магнитное поле с интервалом 6 мс с частотой повторения 20 и 50 Гц при плотностях потока 2,0, 3,0 и 5,0 мТл (от пика до пика) в течение 1 часа в день в течение трех дней. В то время как воздействие PEMF с частотой повторения 20 Гц вызывало значительное увеличение гибели раковых клеток, которое зависело от амплитуды PEMF, PEMF, применяемые с частотой повторения 50 Гц, не оказывали заметного влияния на жизнеспособность клеток и не рассматривались в дальнейшем. в этой рукописи ( рис. S2 AB). Чтобы проверить эффекты различной продолжительности воздействия, клетки подвергали воздействию PEMF величиной 3 мТл и с частотой повторения 20 Гц в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение одного, двух или трех дней. Клетки собирали и анализировали в первый, второй или третий день для анализа, в зависимости от проводимого анализа.
Анализ трипанового синего
После данного протокола воздействия PEMF клетки отделяли, центрифугировали при 1200 rcf в течение 5 минут, ресуспендировали в 1 мл PBS и инкубировали в трипановом синем при 1-1 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Затем гомогенную суспензию клеток помещали в камеру Беркера (BRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Германия), просматривали под микроскопом и подсчитывали. Процент мертвых клеток был получен путем расчета соотношения положительных по трипановому синему клеток в обработанных и необработанных образцах. В некоторых случаях клеткам давали возможность восстановиться в течение 48 часов после их последнего воздействия PEMF. Затем эти клетки отделяли, окрашивали трипановым синим (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и рассчитывали количество мертвых клеток относительно контроля.
Определение апоптоза путем обнаружения разрыва цепи ДНК
Апоптоз измеряли с помощью набора Apo-direct (BD biosciences, Allschwil, Швейцария), который маркирует разрывы цепи ДНК с использованием FITC-dUTP. После каждой обработки собирали 5 × 10 5 клеток, затем фиксировали и окрашивали в соответствии с инструкциями производителя. Анализ проводили на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil, Швейцария) с использованием положительного и отрицательного контролей, предоставленных в наборе, а также дополнительного положительного контроля (гибель), полученного путем воздействия на клетки MCF7 или MCF10 1 мМ H 2. O 2 на ночь. Н 2 О 2применение таким образом привело к летальности 87% ± 2% (+/– SD, n = 4) и 82% ± 3% (+/– SD, n = 4) для клеток MCF7 и MCF10, соответственно. Флуоресценция FITC (520 нм) была обнаружена в канале FL1 и количественно определяет количество разрывов цепи ДНК. Для каждого измерения собирали 20 000 клеток и анализировали с помощью программного обеспечения Flow Jo (версия 7.6.5) (Tree Star Inc., ON, США).
Анализ электрических свойств клеток с помощью микропоточного цитометра Impedance.
Проточная цитометрия с импедансом (IFC) была проведена на прототипе, предоставленном Amphasys AG (Root Längenbold (LU), Швейцария). Вкратце, устройство состоит из микрожидкостного чипа, оснащенного парой микроэлектродов, которые измеряют изменения электрического импеданса, когда клетки проходят через точки двойного опроса в ответ на переменный ток на четырех определяемых пользователем частотах: средней (MF) и высокой. частотные (HF) диапазоны [11] — [15] . Полученные данные (амплитуда, фаза и скорость клеток) были автоматически преобразованы в стандартный формат FCS3 и проанализированы с помощью Flow Jo (версия 7.6.5) (Tree Star Inc., ON, США).
После обработки клетки собирали, ресуспендировали в PBS в концентрации 4–5 × 10 6 клеток / мл и прокачивали через чип с максимальной скоростью 1 см в секунду, 500–1000 клеток в секунду. Для каждого измерения 20 000 клеток были проанализированы с частотой 0,5 МГц для мониторинга апоптоза [11] — [13] , [15] или 9 МГц для определения метаболического статуса [11] — [14] , [16] — [17]. . Каждый образец анализировали параллельно с шариками из полистирола (8 мкм) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), чтобы получить стандартный отклик сигнала по всему частотному спектру, устанавливая заданное значение.
Определение апоптоза окрашиванием аннексином V
Анализ аннексина V / пропидия йодида (BD biosciences, Allschwil, Швейцария) использовали для мониторинга прогрессирования апоптоза на различных стадиях. Мониторинг двойного окрашивания аннексином V (конъюгированным с FITC) и йодидом пропидия (PI) позволил идентифицировать ранний (аннексин V + и PI -) и поздний апоптоз, а также клетки, подвергшиеся некрозу (мертвые клетки, аннексин V и ПИ +). После каждой процедуры 3 × 10 5клетки собирали и окрашивали в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание анализировали на FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil, Швейцария), записывая 20 000 клеток для каждого измерения. Флуоресценция была обнаружена в каналах FL1 и FL2 для FITC (Аннексин V) и PI, соответственно. Данные были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения Flow Jo (версия 7.6.5) (Tree Star Inc., ON, США).
Статистический анализ
Все данные гистограммы были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (стандартное отклонение) по крайней мере 3 независимых экспериментальных прогонов (диапазон от 3 до 5), состоящих из 1-3 повторов для каждого анализируемого биологического параметра. Точное количество измерений в каждой представленной точке данных указано в легенде рисунка и указано в скобках (n). Статистические данные проводили с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона (двусторонний), сравнивая каждый обработанный образец с относительным контролем (имитационно экспонированный образец) для всех используемых клеточных линий. Значение p <0,05 считалось статистически значимым ( * ), а значение p <0,005 считалось очень значимым ( ** ).
Полученные результаты
PEMFs увеличивают гибель клеток рака груди, как обнаружено включением трипанового синего
Наша цель состояла в том, чтобы разработать набор протоколов лечения, которые потенциально могли бы применяться в клинической практике для замедления роста рака, но при этом быть безвредными для здоровых тканей. Мы сосредоточились на модели клеток рака груди, учитывая наши предыдущие успехи в использовании PEMF для замедления их роста [8]. Чтобы определить чувствительность нормальных и раковых клеток к PEMF, мы подвергали клетки рака молочной железы MCF7 и их нормальные эпителиальные аналоги молочной железы, MCF10, к PEMF величиной от 2 до 5 мТл и с частотой повторения 20 Гц в течение 1 часа в день в течение трех дней. После последнего воздействия (день 3) все образцы собирали и окрашивали трипановым синим для количественной оценки гибели клеток и сравнивали с идентично обработанными контрольными культурами (не подвергавшимися воздействию). В ответ на воздействие 3 мТл PEMF наблюдалось весьма значимое снижение процента выживших клеток MCF7. Напротив, воздействие на идентичные культуры MCF-7 PEMF с амплитудой 2 мТл или 5 мТл приводило к менее значительным уровням гибели клеток (Рис. 1A). С другой стороны, воздействие 3 мТл PEMF, которые оказались наиболее цитотоксичными для раковых клеток MCF-7, было безвредным для клеток MCF10 «дикого типа» (как и 2 и 5 мТл PEMF) и, более того, по-видимому, даже усилило их выживаемость (снижение уровней апоптоза в состоянии покоя) относительно неэкспонированных клеток (см. также рисунок S5 ). Затем мы попытались определить лучший интервал воздействия 3 мТл PEMF для уничтожения клеток рака груди.Рисунок 1Bизображает гибель клеток как функцию продолжительности воздействия 3 мТл PEMF (20 Гц). Клетки подвергали воздействию 3 мТл PEMF в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение 3 дней перед анализом гибели клеток. Клетки MCF7 были наиболее восприимчивы к воздействию PEMF продолжительностью 60 минут, тогда как время воздействия на 50% короче (30 минут) или на 50% дольше (90 минут), чем это привело к значительно меньшему количеству уничтожения клеток (Рис. 1B). Еще раз, жизнеспособность клеток MCF10 не была нарушена воздействием PEMF любой продолжительности. Действительно, оказалось, что PEMF делают клетки MCF10 более устойчивыми к апоптозу, особенно в ответ на 60-минутный режим воздействия, который оказался наиболее цитотоксичным для клеток MCF7 ( Рисунок S5 ). Таким образом, данные показывают дискретный набор параметров PEMF (величина, частота и продолжительность воздействия), которые наиболее цитотоксичны для клеток рака молочной железы, тогда как идентичный набор параметров PEMFs, по-видимому, был безвредным для незлокачественных типов клеток (см. Также рисунки S3 и S4 ).
Обнаружение мертвых клеток трипановым синим после воздействия PEMF в течение 3 дней подряд.
( A ) Процент мертвых клеток MCF-7 и MCF-10 после воздействия 2, 3 или 5 мТл PEMF с частотой 20 Гц в течение 60 минут в день в течение трех дней. Жизнеспособность клеток рака молочной железы MCF7 была значительно снижена воздействием PEMF по сравнению с неэкспонированными образцами (контрольные) или клетками MCF-10 (значения P, слева направо: 0,02857, 0,00004, 0,02857). ( B) Клетки, обработанные PEMF (3 мТл при 20 Гц) в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение 3 дней подряд. Гистограмма отображает процент мертвых раковых клеток по сравнению с неэкспонированными (контрольными) образцами (((PEMFs экспонированные положительные клетки трипанового синего — неэкспонированные положительные клетки трипанового синего) / неэкспонированные положительные клетки трипанового синего)) / общее количество клеток). Шестидесятиминутное воздействие 3 мТл PEMF значительно увеличивало гибель раковых клеток MCF7, тогда как более короткое (30 минут) или более длительное (90 минут) воздействие оказывало меньшее влияние (P-значения, слева направо: 0,03175, 0,00004, 0,00015). Значения представляют собой средние значения по крайней мере 4 независимых экспериментов (n = 4, 12, 4 для 2, 3 и 5 мТл соответственно; n = 5, 12, 8 для 30, 60 и 90 минут соответственно) для клеток MCF7 (среднее ± SD). Всего 5 независимых экспериментов (среднее ± стандартное отклонение) предусмотрено для клеток MCF-10 для всех условий. MCF10 не реагировали на PEMF (3 мТл, 60 минут в день в течение трех дней) (также см.Рисунок S3 ). 50 Гц PEMF (3 мТл в течение 60 минут в день в течение трех дней) были менее эффективны при уничтожении клеток MCF-7 (см. Рисунок S2 ). Потенциальное восстановление раковых клеток MCF-7 после обработки PEMF показано на рисунке S6 .
Чтобы установить, является ли цитотоксичность, вызванная PEMF, о которой здесь сообщается, кумулятивным ответом или требуется пороговый уровень клеточного инсульта, чтобы стать очевидным, мы обрабатывали клетки 3 mT PEMF в течение 60 или 90 минут в день в течение 1, 2 или 3 дней и затем количественно оценили общее количество мертвых и живых клеток. В то время как в неэкспонированных культурах общее количество клеток неуклонно увеличивалось в течение трех дней испытаний, воздействие PEMF в течение 60 или 90 минут в день либо полностью отменяло, либо замедляло увеличение количества клеток, соответственно (Рис 2). С другой стороны, абсолютное количество мертвых (положительных по трипановому синему) клеток не уменьшалось пропорционально уменьшению общего числа клеток, как можно было бы ожидать, если бы пролиферация клеток просто замедлялась, а вместо этого увеличивалась. Примечательно, что на третий день, в ответ на 60 минут ежедневного воздействия PEMF (3 мТл), общее количество клеток в культуре уменьшилось, тогда как общее количество мертвых клеток увеличилось на –40% (+/– 6 % (Стандартное отклонение); n = 12) ((общее количество клеток в контрольном образце — общее количество клеток в обработанном образце) / общее количество клеток в контрольном образце)) и + 20% (+/– 13% (стандартное отклонение); n = 12) ( (мертвые клетки в контрольном образце — мертвые клетки в обработанном образце) / мертвые клетки в контрольном образце)), соответственно, что указывает на повышенную цитотоксичность в ответ на PEMF.Рисунок 3 показывает, что увеличение потери клеток со временем является наибольшим в культурах, обработанных в течение 60 минут в день, а не 90 минут в день.
Динамика развития гибели клеток в ответ на воздействие PEMF.
Гистограммы, показывающие общее количество клеток (темно-серый) и общее количество мертвых клеток (положительный по трипановому синему, светло-серый) через 1, 2 или 3 дня ежедневного воздействия PEMF ( B , D ) или в неэкспонированных (контрольных) культурах ( А , В ). ( A , C ) Необработанные культуры демонстрировали устойчивое увеличение общего количества клеток в течение 3 дней в культуре. ( B ) Воздействие 3 мТл PEMF в течение 60 мин / день отменяет типичное монотонное увеличение общего числа клеток (темно-серый), наблюдаемое в неэкспонированных образцах ( A) одновременно с увеличением количества положительных клеток по трипановому синему (светло-серый), значимость которого возрастала с последовательным ежедневным воздействием PEMF. Общее количество клеток в обработанных образцах снизилось на 40% (+/– 6%) по сравнению с контролем, тогда как количество положительных клеток по трипановому синему увеличилось на 20% (+/– 13%) (общее количество клеток в контрольном образце — общее количество клеток в обработанном образце) / общее количество клеток в контрольном образце) и (мертвые клетки в контрольном образце — мертвые клетки в обработанном образце) / мертвые клетки в контрольном образце) соответственно. ( DВоздействие 3 мТл PEMF в течение 90 мин / день замедляло увеличение общего числа клеток (темно-серый), типичное для контрольных образцов, в сочетании с увеличением количества положительных клеток по трипановому синему (светло-серый), значимость которого увеличивалась с последовательным ежедневным воздействия PEMF. Общее количество клеток в обработанном образце показало снижение на 20% (+/– 4%) по сравнению с контролем, тогда как количество положительных клеток трипанового синего увеличилось на 36% (+/– 10%), (общее количество клеток в контрольном образце — общее количество клеток в обработанном образце) / общее количество клеток в контрольном образце) и (мертвые клетки в контрольном образце — мертвые клетки в обработанном образце) / мертвые клетки в контрольном образце) соответственно. Все значения представляют собой средние значения 4 независимых экспериментов с 3 повторами / экспериментом (n = 12) для временных точек 60 минут / день и 2 повторами / экспериментами (n = 8) для временных точек 90 минут / день. P-значения,
Графики в рамке, изображающие увеличение гибели клеток после 1, 2 или 3 дней последовательной обработки PEMF.
( A ) 3 мТл PEMF в течение 60 мин / день ослабили жизнеспособность раковых клеток MCF7 в достаточной степени, чтобы вызвать зависящее от времени накопление скомпрометированных клеток в течение 1-3 дней. Наиболее значимая степень поражения клеток наблюдалась через 3 дня (4 независимых эксперимента с 3 повторностями / эксперимент (n = 12)) (p-значения, слева направо: 0,3246, 0,02032, 0,00004) (также см.Таблица 1для среднего, высокого значения, низкого значения и среднего абсолютного отклонения от медианы). ( B ) Раковые клетки MCF7, обработанные 3 mT PEMF в течение 90 мин / день в течение 1, 2 или 3 дней. В целом, 90 минут воздействия в день вызывают меньшую цитотоксичность, чем 60 минут в день. Данные были получены из 4 независимых экспериментов с 2 повторами на эксперимент (n = 8) (p-значения, слева направо: 0,2595, 0,02953, 0,00015) (также см.Таблица 2 для среднего, высокого значения, низкого значения и среднего абсолютного отклонения от медианы).
Таблица 1
Мертвые клетки / общее количество клеток в клетках MCF7 после обработки 3 mT PEMF в течение 60 мин / день в течение 3 дней.
| 1 день | День 2 | 3 день | ||||
| Контроль | PEMFs | Контроль | PEMFs | Контроль | PEMFs | |
| Иметь в виду | 0,130 | 0,146 | 0,110 | 0,149 | 0,114 | 0,226 |
| Высокое значение | 0,208 | 0,213 | 0.200 | 0,273 | 0,129 | 0,255 |
| Низкое значение | 0,087 | 0,109 | 0,053 | 0,088 | 0,087 | 0,173 |
| Медиана | 0,125 | 0,141 | 0,100 | 0,133 | 0,116 | 0,233 |
| St dev | 0,035 | 0,0300 | 0,046 | 0,047 | 0,011 | 0,022 |
Значения относятся к коробчатым диаграммам рисунок 3Aпоказывающий количество мертвых клеток / общее количество клеток в обработанных образцах по сравнению с относительными контрольными образцами. Данные были получены из 4 независимых экспериментов (3 повтора / эксперимента, n = 12).
Таблица 2
Мертвые клетки / общее количество клеток в клетках MCF7 после обработки 3 mT PEMF в течение 90 мин / день в течение 3 дней.
| 1 день | День 2 | 3 день | ||||
| Контроль | PEMFs | Контроль | PEMFs | Контроль | PEMFs | |
| Иметь в виду | 0,098 | 0,135 | 0,116 | 0,182 | 0,132 | 0,225 |
| Высокое значение | 0,144 | 0,189 | 0,179 | 0,214 | 0,150 | 0,260 |
| Низкое значение | 0,069 | 0,105 | 0,078 | 0,139 | 0,116 | 0,189 |
| Медиана | 0,093 | 0,129 | 0,096 | 0,188 | 0,131 | 0,224 |
| St dev | 0,024 | 0,029 | 0,038 | 0,026 | 0,013 | 0,026 |
Значения относятся к коробчатым диаграммам рисунок 3Bпоказывающий количество мертвых клеток / общее количество клеток в обработанных образцах по сравнению с относительными контрольными образцами. Данные были получены из 4 независимых экспериментов (2 повтора / эксперимента, n = 8).
Оценка апоптоза, вызванного PEMF, путем обнаружения разрывов цепи ДНК
Наше определение апоптоза методом проточной цитометрии (FCM) было проанализировано с идентичными параметрами PEMF (дни последовательного воздействия, продолжительность воздействия, амплитуда и частота поля), что и для оценки эффективности уничтожения трипановым синим, с идентичными результатами. Рисунок 4Aпоказывает наложение клеток MCF7, подвергнутых воздействию PEMF трех различных интенсивностей (2, 3 или 5 мТл) в течение 60 минут в день. Сдвиг популяции клеток вправо (большие значения FL1-H) отражает большее повреждение ДНК. Как было продемонстрировано ранее, раковые клетки MCF7 особенно уязвимы для 3 mT PEMF.Рисунок 4Bпоказывает степень вызванных 3 mT PEMF разрывов цепи ДНК после 30, 60 или 90 минут воздействия в день. Еще раз, 60 минут 3 mT PEMF в течение трех дней подряд дали наибольшее повреждение ДНК в раковых клетках MCF7. И, опять же, более сильные поля (5 мТл) или более длительные воздействия (90 минут в день) были менее цитотоксичными для клеток MCF7 (Рис. 4A-D). Кроме того, параллельно с нашими результатами по трипановому синему, нормальные эпителиальные клетки молочной железы MCF10 не пострадали ни от одной из протестированных парадигм PEMF, особенно тех, которые, как было обнаружено, были особенно цитотоксичными для клеток MCF7. Действительно, небольшой защитный эффект (сдвиг влево к более низким значениям FL1-H) снова был обнаружен в клетках MCF10 в ответ на параметры PEMF, которые были наиболее цитотоксичными для клеток рака молочной железы MCF7 (Рис. 4E; см. также рисунок S5 ). Чтобы исследовать, было ли ранее описанное увеличение фрагментации ДНК, наблюдаемое в клетках MCF7 после 3 дней обработки PEMF, кумулятивно со временем, мы окрашивали клетки через 1, 2 или 3 последовательных дня воздействия 60 или 90 минут 3 mT PEMF. Хотя PEMF-индуцированное повреждение ДНК увеличивалось со временем, оно действительно получило значимость по сравнению с контрольными уровнями только после третьего дня и было особенно выражено в ответ на 60-минутное ежедневное воздействие (рисунок 5 AD). Таким образом, наш анализ FCM подтверждает и усиливает наши результаты по трипановому синему, показывая, что лечение 3 mT PEMF в течение 60 минут в день было наиболее эффективным в уничтожении клеток рака молочной железы MCF7, оставляя классы здоровых клеток (MCF10) невредимыми.
Определение с помощью FCM повреждения ДНК, вызванного PEMF, в MCF7 (рак) и MCF10 (не канцерогенное).
( A ) Наложение популяций клеток MCF7, обработанных 2, 3 или 5 мТл амплитудами PEMF при 20 Гц в течение 60 минут в день в течение 3 дней. Клетки MCF7, подвергшиеся воздействию 3 мТл PEMF, показали наибольшую степень разрывов цепей ДНК, что отражено в их большей интенсивности флуоресценции (более высокие значения FL1). ( B ) Наложение популяций клеток MCF7, обработанных 3 mT PEMF (20 Гц) в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение трех дней. Самый высокий уровень фрагментации ДНК, вызванной PEMF, наблюдался в ответ на 60-минутное воздействие. ( C) Процент апоптотических клеток MCF7 (относительно контроля), обнаруженный с помощью проточной цитометрии после воздействия 2, 3 или 5 мТл PEMF в течение 60 минут в день в течение 3 дней. Значения представляют собой средние значения 5 независимых экспериментов (единичные повторы (n = 5)) (среднее ± стандартное отклонение); Значения P, слева направо: 0,1, 0,02857 и 0,02857. ( D ) Процент апоптотических клеток MCF7 после воздействия PEMF 3 мТл (20 Гц) в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение трех последовательных дней. Значения представляют собой средние значения 5 независимых экспериментов (единичные повторы (n = 5)) (среднее ± стандартное отклонение); Значения P, слева направо: 0,1, 0,02857 и 0,02857. ( E) Нормальные клетки молочной железы MCF10 не повреждаются параметрами PEMF, которые, как было показано, вызывают наибольший апоптоз в раковых клетках MCF7. Действительно, 3 mT PEMF, применяемые в течение 60 минут в день в течение трех дней, снижали базальную скорость апоптоза в клетках MCF-10, предполагая, что PEMF защищают нормальные клетки. Показанные точечные диаграммы были получены в результате 1 из 5 независимых экспериментов, показывающих репрезентативные ответы. Два разных измерения, полученные в 2 независимых экспериментах, были выбраны для условий 3 мТл 60 мин для рисунков A и B (также см. Рисунок S7 ).
Динамика индукции апоптоза с помощью PEMF в клетках MCF7, определяемая с помощью FCM.
( A ) Наложение клеток MCF7, обработанных 3 mT PEMF в течение 60 мин / день в течение 1, 2 или 3 дней подряд. Повреждения ДНК, вызванные PEMF, нарастали со временем и получили значимость только после 3 последовательных дней воздействия. ( B ) Наложение клеток MCF7, подвергнутых воздействию 3 mT PEMF в течение 90 мин / день в течение 1, 2 или 3 дней подряд. Как и в случае А, статистическая значимость была достигнута только через три дня. Параллельно нашему трипановому синему (цифры 1B, 2 AD и 3 AB ) и FCM (фигура 4 AD ), 90 мин / день воздействия PEMF (3 мТл) были менее цитотоксичными, чем 60 мин / день. ( C ) Процент апоптотических клеток MCF7 (относительно контроля), обнаруженный с помощью проточной цитометрии после воздействия 3 мТл PEMF в течение 60 минут в день в течение от 1 дня до 3 дней. Значения представляют собой средние значения 3, 3 и 5 независимых экспериментов для 1, 2 или 3 дней воздействия, соответственно (1 повтор / эксперимент (всего n = 3, 3, 5, соответственно)) (среднее ± стандартное отклонение); Значения P, слева направо: 0,1, 0,1 и 0,02857. ( D) Процент апоптотических клеток MCF7 после воздействия 3 mT PEMF в течение 90 минут / день в течение 1, 2 или 3 дней подряд. Значения представляют собой средние значения 3, 3 и 5 независимых экспериментов для 1, 2 или 3 дней воздействия, соответственно (единичные повторы (всего n = 3, 3, 5, соответственно)) (среднее ± стандартное отклонение); Значения P, слева направо: 0,1, 0,1 и 0,02857.
Определение апоптоза, индуцированного PEMF, методом проточной цитометрии с импедансом
Импедансная проточная цитометрия (IFC) оценивает жизнеспособность клеток в реальном времени путем мониторинга клеточных электрических свойств в действующих клетках [11] — [13] , [15] . На точечной диаграмме, полученной в результате мониторинга электрических характеристик всей популяции клеток при частоте сканирования 0,5 МГц, мертвые клетки находятся в крайнем нижнем левом квадранте (значения фазы и величины низкого импеданса). PEMFs вызывают сдвиг в клетках MCF7 в нижний левый квадрант, особенно в ответ на 3 mT PEMFs, что дает наибольшее разделение между живыми (справа) и умирающими (слева) клетками (Рис. 6A). Рисунок 6Bпоказывает результаты для клеток MCF7, подвергнутых воздействию 3 mT PEMF в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение трех дней. В соответствии с нашей предыдущей оценкой апоптоза трипановым синим и FCM, клетки, подвергшиеся 60-минутному воздействию 3 мТл PEMF в день, показали наибольший процент мертвых клеток, обнаруженный IFC (Рис.6 CD). В отличие от этого, еще больше подтверждая наши предыдущие результаты, клетки MCF10 немного выиграли от тех же самых параметров PEMF (Рис. 6Eсм. также рисунок S5 ).
Определение апоптоза после PEMF методом импедансной проточной цитометрии (IFC) при 0,5 МГц.
( A ) Точечные графики, полученные для клеток MCF7, подвергнутых воздействию PEMF с амплитудой 2, 3 или 5 мТл в течение 60 минут в день в течение трех дней. Гистограммы выше и справа от каждого точечного графика показывают субпопуляцию апоптотических клеток, заштрихованную черным цветом. Раковые клетки MCF-7, обработанные 3 мТл PEMF, показали наибольшее разделение между жизнеспособными (справа) и нежизнеспособными (слева) популяциями клеток, а также более высокий общий процент мертвых клеток. ( B ) Жизнеспособность клеток MCF7 после воздействия 3 мТл (20 Гц) в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение трех дней. ( C) Процент апоптотических клеток MCF7, обнаруженных IFC в ответ на 2, 3 или 5 мТл PEMF, нормализованный к соответствующему контролю. Каждое значение представляет собой среднее значение 4 независимых экспериментов (1 повтор / эксперимент, n = 4) (± стандартное отклонение); Значения P, слева направо: 0,4818, 0,0004552 и 0,1818. ( D ) Процент мертвых клеток MCF7 в каждом обработанном образце, нормализованный к соответствующему контролю в ответ на 30, 60 или 90 минут воздействия PEMF. Каждое значение представляет собой среднее значение 4 независимых экспериментов (1 повтор / эксперимент, n = 4) (± стандартное отклонение). P-значения, слева направо: 0,1905, 0,0004552 и 0,3929. ( E) Клетки MCF10, обработанные PEMF (3 мТл, 20 Гц) в течение 60 минут / день в течение трех дней. Показанные точечные диаграммы были получены для клеток с той же экспериментальной датой и представляют ответы клеток, наблюдаемые во всех независимых экспериментах с идентичными условиями. Два разных повтора, полученные из 2 независимых экспериментов, были выбраны для условий 3 мТл, 60 минут для рисунков A и B. Также см. Рисунок S8 для разброса индивидуальных измерений.
Оценка метаболического статуса клеток после обработки PEMF с IFC
На более высоких частотах сканирования IFC определяет метаболический статус [11] — [14] , [16] . При частоте сканирования 9 МГц IFC обнаруживает две популяции клеток, самая правая популяция (более высокие значения фазы) отражает клетки, испытывающие начальные стадии метаболического стресса [11] — [14] , [16] — [17] . После трех дней воздействия PEMF на клетки MCF7 величина самой правой популяции увеличилась, причем наибольший сдвиг вправо точно совпадал с этими параметрами (3 мТл, 20 Гц, в течение 60 мин / день в течение 3 дней), вызывая наибольшую гибель клеток в ответ на PEMF (Рис 7 AD). И, опять же, нормальные клетки молочной железы MCF10, по-видимому, получили пользу от PEMF, как определено анализом IFC на частоте 9 МГц (Рис 7 Dсм. также рисунок S5 ). Из-за относительно широкого диапазона фенотипа (метаболический стресс) эффект является самым большим, который мы измерили в ответ на PEMF (см. Далее, см. Также рисунок S5 ).
Состояние метаболизма клеток MCF7 и MCF10 анализируется IFC на частоте 9 МГц.
( A ) Точечные графики, полученные для клеток MCF7 после воздействия PEMF 2, 3 или 5 мТл и в контрольных (необлученных) образцах и проанализированные при частоте сканирования 9 МГц. Экспонированные образцы показали большую правостороннюю популяцию, особенно после воздействия 3 мТл PEMF. ( B ) Точечные диаграммы клеток MCF7 после воздействия PEMFs (3 мТл, 20 Гц) в течение 30, 60 или 90 минут в день в течение 3 дней; правосторонняя популяция преимущественно увеличивалась в ответ на 60-минутную экспозицию. ( CГистограммы, изображающие процентное увеличение размера правой популяции, нормализованное к контрольным, после воздействия 2, 3 или 5 мТл PEMF в течение 60 минут. Каждое значение представляет собой среднее значение 4 независимых экспериментов (1 повтор / эксперимент, n = 4) (± стандартное отклонение). P-значения слева направо: 0,00879, 0,0017 и 0,07033. ( D ) размер правой популяции как функция продолжительности воздействия и нормализованный для каждого соответствующего контрольного (неэкспонированного) образца; правосторонняя популяция преимущественно увеличивалась в ответ на 60-минутную экспозицию. Каждое значение представляет собой среднее значение 4 независимых экспериментов (1 повтор / эксперимент, n = 4) (± стандартное отклонение). P-значения, слева направо: 0,6786, 0,0017 и 1. ( E) Точечные диаграммы, полученные для клеток MCF10, подвергнутых воздействию 3 мТл PEMF (20 Гц) в течение 60 минут / день в течение трех дней, и в контрольных (неэкспонированных) образцах, демонстрирующие, по существу, отсутствие изменений в ответ на лечение. Показанные точечные диаграммы были получены для клеток с той же экспериментальной датой и представляют ответы клеток, наблюдаемые во всех независимых экспериментах с идентичными условиями. Также см. Рисунок S8 для разброса отдельных измерений.
Для независимой проверки того, что IFC эффективно определяет апоптоз и метаболический статус в нашей клеточной системе, мы обработали рак MCF7 и нормальные клетки MCF10 1 мМ H 2 O 2, чтобы вызвать гибель клеток до степени 87% ± 2% (+/– SD, n = 4) и 82% ± 3% (+/– SD, n = 4) соответственно. При анализе с помощью IFC при частоте сканирования 0,5 МГц клетки, обработанные H 2 O 2, были смещены в крайний нижний левый квадрант (Рис. 8A; срРис. 6A-D). Кроме того, подтверждая, что популяция клеток, испытывающая начальные стадии метаболического стресса, действительно сдвинута вправо (при сканировании IFC на 9 МГц), мы получили аналогичный сдвиг вправо в клетках MCF7 после воздействия в течение ночи 1 мМ H 2 O 2 (Рис. 8B; срРис. 7A-D). Следовательно, IFC действительно кажется жизнеспособным методом мониторинга жизнеспособности раковых клеток.
Независимое подтверждение того, что IFC обнаруживает поврежденные ячейки на частотах 0,5 МГц и 9 МГц.
( A ) Сравнение точечных графиков (слева) и гистограмм амплитуд (слева (вверху, вставка) и справа (вертикальное расширение)), созданных для клеток MCF7, подвергнутых воздействию PEMF или H 2 O 2 на 0,5 МГц. PEMFs вызывают аналогичные смещения популяции в нижний левый квадрант точечной диаграммы (более низкие значения фазы и величины), как и в образцах, обработанных H 2 O 2 : необработанные клетки (серые), клетки, подвергшиеся воздействию PEMF (3 мТл, 20 Гц в течение 60 мин / день в течение 3 дней; 25% мертвых клеток: черные) и клетки инкубировали в течение ночи с H 2 O 2 (1 мМ; 87% мертвых клеток: светло-голубые). ( B ) Гистограммы амплитуды, соответствующие точечным диаграммам, созданным из ячеек MCF7 и проанализированным IFC на частоте 9 МГц. ЧАСОбработка 2 O 2 (1 мМ; приводящая к 87% гибели клеток) вызвала смещение всей популяции клеток вправо; горизонтальные полосы указывают ворота включения. Сдвиг вправо после индукции смерти ясно показано в наложении контроля (необработанных; серый), ИЭМП-открытые клетки (черный) и Н 2 O 2 обработанных образцов (светло — голубой) в панели C . Точечные диаграммы были созданы для клеток с той же экспериментальной датой и представляют ответы клеток, наблюдаемые во всех независимых экспериментах с идентичными условиями. Включение трипанового синего использовали для количественной оценки процента гибели клеток в образцах, обработанных H 2 O 2 .
Оценка апоптоза, индуцированного PEMF, путем окрашивания аннексином V.
Чтобы еще больше подтвердить наши данные трипанового синего, FCM и IFC, демонстрирующие индукцию апоптоза в раковых клетках MCF7 в ответ на воздействие PEMF, мы провели анализы аннексина V / PI, дифференцируя клетки в раннем апоптозе (Аннексин V + / PI-) от мертвых и поврежденных. клетки (пропидия йодид +). Клетки MCF7 (раковые) и MCF10 (нормальные) подвергались непосредственному воздействию парадигм PEMF, которые, как мы ранее обнаружили, наиболее цитотоксичны для клеток MCF7, 3 мТл в течение 60 минут в день.Рисунок 9Aпоказывает, что обработка PEMF привела к увеличению количества клеток Аннексин V + MCF7 на 13% по сравнению с контролем, что количественно согласуется с другими нашими оценками цитотоксичности, индуцированными PEMF, с использованием трипанового синего (обработанный — контроль: 11% мертвых клеток), FCM (обработанный — контроль: 14% мертвых клеток), IFC при частоте сканирования 0,5 МГц (обработанные — контроль: 16% мертвых клеток) и IFC при частоте сканирования 9 МГц (обработанные — контроль: 25%). Как ранее было продемонстрировано с помощью всех других проведенных нами анализов апоптоза, на клетки MCF10 не оказали неблагоприятного воздействия те же самые параметры PEMF (Рис 9B) (см. также рисунок S5 ).
Оценка апоптоза, вызванного PEMF, с помощью анализа аннексина V.
Клетки MCF7 (рак) и MCF10 (неканцерогенные) обрабатывали парадигмами PEMF, вызывающими наибольшую гибель клеток в MCF7 (3 мТл в течение 60 мин / день в течение 3 дней подряд). ( A ) Точечные графики, полученные с помощью анализа FCM клеток MCF7, показывают большее увеличение доли клеток на ранней (Аннексин V + / PI-) и более поздних стадиях апоптоза (Аннексин V + / PI +) в обработанных образцах (слева) по сравнению с контролем ( неэкспонированные) образцы (справа). ( B ) MCF10 (неканцерогенные) клетки, по-видимому, не пострадали от PEMF, что подчеркивается аналогичным количеством жизнеспособных клеток в обработанных (89%) и неэкспонированных (80%) культурах.
Обсуждение
Мотивированные исследованиями, демонстрирующими безопасность PEMF очень низкой частоты и интенсивности [4] , [6] и расширяющие нашу предыдущую работу [8] , демонстрирующие, что раковые клетки MCF7 избирательно уязвимы для импульсных электромагнитных полей частотой 20 Гц, мы исследовали эффекты PEMFs на эпителиальных клетках молочной железы человека злокачественного (MCF7) и незлокачественного (MCF10) фенотипа. Цитотоксическая чувствительность к определенным параметрам PEMFs была полностью ограничена злокачественным фенотипом и демонстрировала четкую зависимость от продолжительности, частоты и интенсивности используемых PEMF. В частности, клетки рака груди линии MCF7 были наиболее уязвимы для PEMF величиной 3 мТл при частоте повторения 20 Гц и интервале воздействия 60 минут в день (Рис.1 AC). Эти же параметры PEMF, хотя и цитотоксичны по отношению к клеткам MCF7, были слегка защитными по отношению к доброкачественным эпителиальным клеткам молочной железы идентичной линии хозяина, MCF10 (см. Рисунок S5.). Для этих экспериментов мы ограничили наш анализ тремя днями воздействия, чтобы оставаться в рамках клинически осуществимой терапевтической стратегии. Три дня также были выбраны в качестве подходящей конечной точки для нашего анализа, так как это позволило избежать чрезмерного роста контрольных клеток. В парадигме тканевой культуры, такой как наша, оставаясь ниже слияния клеток, можно было бы минимизировать потенциальный вклад изменений биохимического статуса, вызванных плотностью клеток / контактом, или недостаток питательных веществ в наши измеренные различия. Следовательно, остается возможность, что увеличение количества дней воздействия PEMF может повысить специфичность и эффективность уничтожения раковых клеток. Планирование экспериментов с более длительным курсом времени будет в центре внимания наших будущих исследований. Тем не менее, наши результаты,[5] , [7] , [9] , [18] — [19] .
В этом исследовании мы сосредоточили наше внимание на параметрах PEMF, которые: 1 ) могли практически применяться в клинической практике с учетом продолжительности воздействия и 2 ) были безвредными для классов здоровых клеток, сопутствующих воздействию PEMF во время клинического лечения. Наши результаты примечательны, учитывая, что: 1 ) наше наиболее эффективное время воздействия для индукции гибели раковых клеток (MCF7) составляло всего один час на воздействие, а не 3–72 часа, как сообщалось ранее [5] , [20] — [21] и; 2) разработанные нами полевые парадигмы были явно безвредны для нормальных клеток (MCF10). Пока что мы не достигли полного «выборочного» уничтожения с помощью PEMF. Хотя эта цель может быть достигнута с помощью дальнейшей тонкой настройки параметров PEMF (величина воздействия, продолжительность, форма сигнала, количество дней лечения), мы не можем исключить возможность того, что другой тип тканей может быть вовлечен в пул смерти. Однако весьма примечательными были диаметрально противоположные ответы клеток MCF7 (рак) и MCF10 (нормальные) на PEMF, что увеличивало цитотоксический разрыв между подвергнутыми воздействию раком и воздействием нормальных клеток. Потенциально, PEMF могут оказаться полезными в качестве неинвазивного адъювантного лечения в сочетании с другими распространенными противораковыми методами лечения.
Избирательное уничтожение раковых клеток с помощью PEMF было подтверждено четырьмя независимыми методологиями с использованием пяти различных аналитических парадигм, охватывающих весь спектр стадий, ведущих к окончательной гибели клеток. Во-первых, наши результаты по трипановому синему дали количество клеток на поздней стадии отмирания клеток, известной как «постапоптотический некроз» или «вторичный некроз» (Рис.1 AB, 2 г. н.э. а также 3 АБ) [18] , [22] — [23] . Во-вторых, наш анализ FCM обнаружил разрывы ДНК до гибели клеток [17] , [24] и происходящие после активации кальций-стимулированной каспазы (Рис. 4 AE а также 5 г. н.э.) [25] . В-третьих, мы исследовали прогрессирование апоптоза с помощью проточной цитометрии импеданса (IFC), которая обнаруживает изменения электрических свойств клеток, отражающие физиологический статус [11] — [17] , [24] , [26] — [27] на двух частотах: 1 ) 0,5 МГц, чтобы определить количество клеток, подвергшихся апоптозу (Рис. 6 AE) [11] — [13] , [15] и 2 ) 9 МГц, чтобы отслеживать изменения, которые совпадают с началом клеточного стресса (Рис 7 AE) [11] — [14] , [16] — [17] . Несколько недавних публикаций подтвердили ценность IFC для измерения жизнеспособности клеток [11] — [17] , [27] . Наконец, мы использовали анализ аннексина V / PI, чтобы отличить клетки с ранним апоптозом от поврежденных или уже мертвых клеток (Рис.9 AB) [28] — [29] . Во всех пяти анализах жизнеспособности клеток идентичные параметры PEMF вызывали наибольшую степень повреждения клеток рака молочной железы MCF-7, интенсивность 3 мТл в течение 60 минут в день, демонстрируя четкое и дискретное окно уязвимости клеток MCF7 к PEMF с заданными характеристиками. . Более сильные поля, более длительное воздействие или более высокая частота этих эмпирически определенных значений (3 мТл, 20 Гц, 60 минут воздействия в день) были менее цитотоксичными для клеток MCF7, что ясно демонстрирует важность оптимизации поля для возможного уничтожения классов злокачественных клеток с помощью PEMF.
Существует четкое окно уязвимости раковых клеток к PEMF; больше не обязательно лучше . То, что более слабые поля или меньшее воздействие на них менее смертоносно, на первый взгляд может показаться интуитивным. Однако тот факт, что более сильное или более продолжительное воздействие полей менее эффективно для уничтожения, подразумевает определенное биологическое действие, а не прямое дозозависимое накопление общего повреждения над статусом восприимчивых клеток. Достоверность описанного эффекта окна неявно подтверждается в контексте наших данных, представленных здесь, тем фактом, что пять независимых анализов (четыре различные методологии) измерения жизнеспособности клеток дали идентичный результат и дали одинаковые величины гибели клеток (также см. Рисунок S5.). Зависимость цитотоксичности от продолжительности воздействия была настолько сильной, что она также была очевидна при изучении динамики развития цитотоксичности в течение трех дней последовательного воздействия PEMF. То есть 60-минутное ежедневное воздействие PEMF дает более высокие коэффициенты гибели клеток (фигура 3) и большее количество фрагментов ДНК (цифра 5), чем 90 минут ежедневного воздействия. Более того, параметры PEMF, которые были наиболее цитотоксичными для клеток рака молочной железы MCF7, оказались наиболее полезными для нормальных клеток молочной железы MCF10. О подобных оконных эффектах сообщалось в области электромагнетизма и открыто обсуждались в литературе, но пока нет общепринятых моделей, объясняющих их существование [19] , [30] — [31] . В докладе о руководящих принципах защиты Международной комиссии по неионизирующему излучению [30]утверждается: «Интерпретация нескольких наблюдаемых биологических эффектов электромагнитных полей AM (амплитудно-модулированных) дополнительно осложняется очевидным существованием« окон »отклика как в области плотности мощности, так и в частотной области. Не существует общепринятых моделей, которые бы адекватно объясняли это явление, что ставит под сомнение традиционную концепцию монотонной связи между напряженностью поля и серьезностью возникающих в результате биологических эффектов ».
Однако на данном этапе относительный вклад фактического замедления пролиферации клеток и индукции гибели клеток в общий эффект PEMFs неясен (см. фигура 2), как и скорость и степень поглощения мертвых клеток культурой после их гибели. Следовательно, хотя прерывание клеточного цикла, возможно, вызванное PEMFs, может способствовать наблюдениям, о которых здесь сообщается, наиболее непосредственно измеримый эффект — это эффект индуцированного апоптоза. Тем не менее, способность PEMF замедлять пролиферацию класса раковых клеток также будет положительным клиническим результатом и будет иметь значение для продвижения противораковых терапий на основе PEMF.
Молекулярные механизмы, посредством которых раковые (MCF7) клетки скомпрометированы, а здоровые (MCF10) клетки еще не полностью изучены, и все же имеют первостепенное значение для окончательной разработки основанных на PEMF стратегий борьбы с раком и будут в центре наших будущих исследований. Мы предполагаем, что эффект окна, наблюдаемый в этом исследовании, является результатом изменений во внутриклеточной обработке кальция в ответ на воздействие PEMF. Передача сигналов кальция известна своими мультимодальными эффектами, основанными на приросте внутриклеточного кальция, который: 1 ) является результатом как притока кальция через мембрану клеточной поверхности, так и высвобождения из ограниченных внутриклеточной мембраной компартментов; 2 ) кодируются одновременно в пространстве, времени и уровне ожидания; 3) демонстрируют механизмы регулирования с отрицательной и положительной обратной связью; 4 ) координируются динамическими изменениями мембранной организации [32] — [33] . Как обычно сообщается, следствием воздействия PEMF является повышение уровня внутриклеточного кальция [34], одна из возможностей заключается в том, что PEMF опосредуют свои эффекты, влияя на пути передачи сигналов внутриклеточного кальция. В контексте этого отчета 3 мТл PEMF с частотой 20 Гц в течение 60 минут в день создадут «правильную» комбинацию сигналов кальция, которая наиболее эффективно приведет к гибели клеток. Действительно, ранее было показано, что хелатирование или увеличение внутриклеточного кальция соответственно сохраняет или ставит под угрозу выживаемость MCF7, соответственно [35] —[37] . Сдвиг вправо, наблюдаемый на частоте 9 МГц в IFC (Рис 4 AD), вероятно, отражает изменения в сложности мембран и реорганизации цитоплазмы (изменение емкости всей клетки) [11] — [14] , [16] — [17], которые совпадают с установлением цитоморфологических особенностей, которые отражают модуляцию биохимических путей, которые, в свою очередь, регулируют тонкий баланс между пролиферацией клеток и апоптозом, включая модификации митохондриального метаболизма после изменений внутриклеточных уровней кальция [16] — [17] , [33] , [38] . Наши будущие исследования будут сосредоточены на влиянии PEMF на приросты кальция в цитозоле.
Незлокачественные клетки MCF10 не были затронуты или даже усилены парадигмами PEMF, вызывающими наибольшие повреждения в клетках MCF7, что выявляет другой уровень специфичности действия и поддерживает возможность того, что в конечном итоге может быть осуществимо выборочное удаление раковых клеток из организма без вовлечение нормальных тканей в пул смерти с использованием технологий на основе PEMF (Рис 1 AB, , 4E,4E, , 6E,6E, , 7E,7E, , 9Б9Bа также ). Иммунитет клеток MCF10 к PEMFs может указывать на то, что их эндогенные кальциевые гомеостатические механизмы способны буферизовать или даже использовать небольшие приросты внутриклеточных концентраций кальция, тогда как клетки MCF7 не способны выдерживать даже умеренные нарушения цитозольных уровней кальция, предположение, что подтверждается недавно опубликованными исследованиями [36] — [37] . В качестве дополнительной поддержки такого зависимого от кальция механизма преимущественного уничтожения злокачественных клеток было показано, что панаксидол, производное женьшеня Panax, которое вызывает устойчивое повышение уровня цитозольного кальция, предпочтительно индуцирует апоптоз в раковых клетках (включая MCF7), но не в нормальных клетках. [39]. Такой селективный кальций-зависимый механизм уничтожения раковых клеток может в конечном итоге помочь в совершенствовании технологий на основе PEMF, чтобы лучше выполнять преимущественное уничтожение клеток рака груди в клинических условиях.
Вспомогательная информация
Рисунок S1
Система экспонирования PEMF.
(PNG)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (291K, png)
Рисунок S2
Окрашивание трипановым синим раковых клеток MCF7, подвергшихся воздействию импульсных электромагнитных полей (PEMF) с частотой 50 Гц.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (403К, tif)
Рисунок S3
Окрашивание трипановым синим нормальных (человеческая грудь MCF10 и мышца мыши C2C12) и раковых (человеческая грудь MCF7) клеток, подвергшихся воздействию PEMF.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (531К, tif)
Рисунок S4
Скорость роста раковых клеток MCF7 после обработки PEMF или в контрольных культурах через 3 дня.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (1,4 млн, tif)
Рисунок S5
Последовательные диаметрально противоположные ответы неканцерогенных клеток MCF10 и раковых клеток MCF7 на обработку PEMF наблюдались в 5 различных анализах жизнеспособности клеток.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (228К, в формате tif)
Рисунок S6
Обратимость цитотоксических эффектов PEMF.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (224К, в формате tif)
Рисунок S7
Определение FCM разрывов цепей ДНК в раковых клетках MCF7 после воздействия PEMF.
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (489К, в формате tif)
Рисунок S8
Наблюдаемый диапазон ответов образца в раковых клетках MCF7 после воздействия параметров PEMF, вызывающих наибольшую цитотоксичность (3 мТл, 20 Гц, 60 минут в день в течение трех дней).
(TIF)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (1,0 млн, tif)
Текст S1
Описание системы экспонирования PEMF.
(DOC)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (29К, док)
Текст S2
Дополнительные условные обозначения фигур.
(DOC)
Щелкните здесь, чтобы просмотреть дополнительный файл данных. (42К, док)
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить доктора Malgorzata Kisielow и г-жу Anette Schütz из лаборатории проточной цитометрии ETH и Университета Цюриха за квалифицированную техническую помощь во время приобретения и анализа FCM. Наконец, мы хотели бы поблагодарить группу статистических консультантов ETH за их помощь в разработке нашего статистического анализа.
Отчет о финансировании
Это исследование было частично поддержано Швейцарским федеральным управлением общественного здравоохранения ( http://www.bag.admin.ch/ ) в соответствии с мандатом № 11.003272 «Влияние импульсных электромагнитных полей на распространение различных типов механочувствительных клеток». . Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Дополнительного внешнего финансирования для этого исследования не получено.
использованная литература
