.svg)
Введение
Рак молочной железы является ведущей причиной смерти женщин от рака во всем мире ( 1 ). Приблизительно у 1 из 8 женщин в США будет диагностирован инвазивный рак молочной железы в течение жизни ( 2 ), и, хотя химиотерапия является основным методом лечения рака молочной железы, более 50% женщин, получающих химиотерапию, испытают по крайней мере один связанный с химиотерапией рак. нежелательное явление ( 3 ). Существует острая необходимость в сопутствующей терапии для улучшения результатов химиотерапии в надежде на смягчение связанных с ней нежелательных явлений и снижение токсичности, связанной с лечением.
Доксорубицин (DOX) является наиболее широко используемым химиотерапевтическим средством для лечения рака молочной железы и других видов рака ( 3 ). Противораковые эффекты DOX объясняются его способностью как ингибировать репликацию ДНК в активно пролиферирующих раковых клетках ( 4 ), так и увеличивать выработку активных форм кислорода (АФК) посредством нарушения окислительно-восстановительного цикла, тем самым вызывая окислительное повреждение липидов, ДНК. и белки ( 3 ). Последующее митохондриальное повреждение еще больше усиливает продукцию АФК, связанную с DOX, что усугубляет окислительное повреждение ( 4 ).
Было показано, что кратковременное воздействие (10 мин) низкоамплитудных (1 мТл) пульсирующих магнитных полей (PEMF) способно стимулировать митохондриальное дыхание и выработку АФК ( 5 ), тем самым способствуя миогенезу как in vitro ( 5 ), так и in vivo ( 6 ) посредством процесс магнитного митогормезиса. Подчиняясь митогорметическому механизму действия ( 7), кратковременное воздействие PEMF с низкой амплитудой будет вызывать достаточно низкие уровни ROS, чтобы вызвать адаптацию к выживанию митохондрий, тогда как можно ожидать, что преувеличенное воздействие PEMF вызовет вредный окислительный стресс, который вместо этого помешает выживанию клеток. Важно отметить, что порог достижения необратимо повреждающего уровня окислительного стресса будет зависеть от скорости основного обмена и существующего воспалительного статуса клеток-реципиентов. Таким образом, рак, характеризующийся повышенной скоростью метаболизма, может быть предрасположен к метаболической катастрофе, вызванной ИЭМП ( 8 , 9 ).). Соответственно, ранее было показано, что воздействие 3 мТ PEMF в течение одного часа является цитотоксическим для клеток рака молочной железы MCF-7, тогда как такая же парадигма воздействия переносилась незлокачественными клетками молочной железы MCF10A ( 10 ).
Экспрессия канала Transient Receptor Potential Canonical 1 (TRPC1) необходима и достаточна для обеспечения митохондриального дыхания, стимулированного PEMF ( 11 ). Доказательства наличия TRPC1-митохондриальной оси существуют с выводами о том, что поступление кальция модулирует митохондриальное дыхание ( 12 ), тогда как митохондриальные АФК реципрокно модулируют функцию TRPC1 ( 13 ). Кальций, опосредованный TRPC1, был идентифицирован как точка уязвимости, которую можно использовать для подрыва жизнеспособности рака ( 14 , 15 ) путем захвата зависимого от кальция/АФК пути цитотоксичности ( 16 , 17 ). TRPC1 и TRPM7 являются наиболее обильно экспрессируемыми из всех каналов TRP ( 18), подчеркивая их физиологическое и, следовательно, клиническое значение. Повышенные уровни экспрессии TRPC1, TRPC6, TRPM7, TRPM8 и TRPV6 обнаруживаются в клетках аденокарциномы протоков молочной железы человека (hBDA) ( 19 ), при этом экспрессия TRPC1, TRPM7 и TRPM8 наиболее тесно коррелирует с пролиферативной дерегуляцией и ростом опухоли. и TRPV6 более сильно коррелировал с инвазивным раком молочной железы. С другой стороны, при раке яичников высокой гистопатологической степени экспрессия TRPC1 отрицательно коррелирует с химиорезистентностью ( 20 ). И наоборот, было показано, что лечение DOX вызывает генотипические и фенотипические модификации, которые делают раковые клетки невосприимчивыми к химиотерапии ( 21 ).). В то время как химиотерапевтические агенты, цисплатин и карбоплатин, способны подавлять экспрессию канала TRPC1 в клеточных линиях рака яичников ( 20 ), влияние DOX на экспрессию канала TRPC1 при раке молочной железы не изучено.
Учитывая заявленную способность PEMF нацеливаться на клетки рака молочной железы, а также на TRPC1 ( 5 , 10 ), мы предположили, что эффекты лечения DOX и PEMF могут синергизировать, чтобы подорвать рост рака молочной железы. Мы изучили независимые и комбинированные возможности лечения DOX и PEMF как in vitro , так и in vivo , чтобы подорвать рост рака. Кроме того, учитывая предыдущие данные, демонстрирующие, что воздействие PEMF модулирует функцию TRPC1 ( 5), мы исследовали, предсказывает ли уровень экспрессии TRPC1 уязвимость рака молочной железы к лечению DOX и PEMF. Эксперименты со сверхэкспрессией и молчанием были проведены для подтверждения обнаруженных тенденций в чувствительности PEMF и DOX, связанных с экспрессией эндогенного канала TRPC1, а также для исследования склонности образующихся клеток рака молочной железы к эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), что обеспечило бы клиническую значимость для исследования. повышенная чувствительность к PEMF и DOX, обусловленная TRPC1.
Материалы и методы
Модель ксенотрансплантата рака молочной железы MCF-7 и ксенотрансплантата пациента (PDX) у мышей NSG
Мышей NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ), у которых отсутствуют специфичные для человека цитокины и экспрессия человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) на стромальных клетках, использовали для размещения клеточных линий рака молочной железы или ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDX) ( 22 ). Мышей NSG приобретали в лаборатории Джексона и использовали в возрасте 8-10 недель. Вкратце, каждой самке мыши NSG имплантировали подкожно 60-дневный (0,36 мг) гранул эстрадиола с медленным высвобождением (Innovative Research of America). Опухоль каждого пациента была поровну разделена на 5 частей и имплантирована в спинной бок 5 животных, соответствующих 5 различным группам лечения. Опухоли давали расти в течение 3 недель. Для МКФ-7, 1х10 6клетки подсчитывали и смешивали в соотношении 40-60% с фактором роста Matrigel (Bio Laboratories, кат. № 354230). Клетки вводят подкожно в спинной бок животных, соответствующих различным группам лечения. Животным вводили 20 мг/кг DOX внутривенно и/или стимуляцию PEMF в течение 1 часа еженедельно в течение 5 недель. В конце исследования измеряли объем опухоли и выделяли ее для определения апоптотических клеток.
Модель хориоаллантоисной мембраны цыпленка (CAM)
Анализ куриной хориоаллантоисной мембраны (САМ) ( 23 ) проводили с использованием оплодотворенных куриных яиц Bovans Goldline Brown, приобретенных у Chew’s Agriculture Pte Ltd и Lian Wah Hang Farm Pte Ltd, Сингапур. Вкратце, яйца помещали горизонтально в гумусированную камеру с температурой 38,5°C и влажностью 70% на 3 дня. На 3-й день через отверстие в верхушке яиц с помощью иглы 18G на шприце объемом 5 мл удаляли от 3 до 4 мл альбумина для снижения САМ. Затем в центре яиц делали овальное отверстие площадью 1 см 2 и закрывали его полупроницаемой мембраной Tegaderm 1624W. На 7-й день яйца инокулировали 1,5 х 10 6Клетки MCF-7 ресуспендировали в 50 мкл Matrigel (Sigma Aldrich) на кровеносном сосуде САМ. Перед инокуляцией клеток MCF-7 кровеносные сосуды, расположенные ближе к САМ, осторожно перфорировали с помощью сухой стеклянной палочки. Яйца повторно запечатывали с помощью Tegaderm и оставляли еще на 3 дня. Затем яйца подвергали стимуляции PEMF на 10, 11, 12 и 13 дни в течение 1 часа каждый день. Массу опухоли определяли на 14-й день и впоследствии обрабатывали для вестерн-анализа. Для введения DOX готовили DOX в физиологическом растворе в концентрации 0,04 мкг на грамм яйца в общем объеме 20 мкл и добавляли на небольшую стерильную фильтровальную бумагу, помещенную на сосуд САМ рядом с опухолью. DOX добавляли за 1 час до первого воздействия PEMF.
Гистологический анализ и анализ TUNEL
Изолированные опухоли MCF-7 и печень куриных эмбрионов фиксировали в 2,5% PFA и 15% сахарозе в PBS в течение 24 ч при 4°C. Ткани заливали криопротектором Tissue-Tek® OCT Compound и делали срезы толщиной 10 мкМ. Анализ TUNEL выполняли с использованием набора для анализа Click-iT Plus TUNEL (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Для биопсии молочной железы человека ткани хранили в среде RPMI с добавлением 10% FBS и подвергали воздействию 3 мТ PEMF в течение 1 часа. Их выдерживали в стандартном инкубаторе для тканевых культур в течение 24 часов перед фиксацией с использованием 4% PFA в течение ночи, которые затем обрабатывали и заливали в парафиновые блоки. Биопсии ткани делали на срезы толщиной 5 мкм и окрашивали In Situ.Набор для обнаружения гибели клеток (Roche) согласно инструкции производителя. Окрашенные срезы просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus FV1000.
Клеточная культура и фармакология
Клетки MCF-7 (HTB-22™) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и выдержаны в RPMI (Gibco) с добавлением 10% FBS (Hyclone) во влажном инкубаторе при 37°C в 5% CO2 .. Клетки MDA-MB-231 были любезным подарком доктора Гленна Бонни, NUS, и их подлинность была подтверждена ATCC с использованием профилирования человеческого STR (короткий тандемный повтор). Клетки MCF10A были приобретены в лаборатории доктора Эндрю Тана (NTU). Клетки MDA-MB-231 поддерживали в DMEM (Gibco) и 10% FBS. Клетки MCF10A поддерживали в питательной среде, содержащей DMEM/F12 (Gibco) с добавлением 5% лошадиной сыворотки (Hyclone), 20 нг/мл EGF (Peprotech), 0,5 мг/мл гидрокортизона (Sigma), 100 нг/мл холерного токсина (Sigma). ) и 10 мкг/мл инсулина (Sigma). Клетки трипсинизировали и пассировали каждые 3 дня с использованием реагента TrypLE Express (Gibco). Клетки MCF-7/ADR, устойчивые к 96 нМ DOX, были созданы с использованием постепенной инкубации клеток в низких концентрациях от 0,3 нМ до 96 нМ DOX в течение 4 месяцев. Концентрацию DOX удваивали еженедельно после пересева клеток. Доксорубицина гидрохлорид (DOX) (Abcam, ab120629) восстанавливали в ДМСО для получения исходной концентрации 25 мМ и хранили при -80°C. Последующие разведения DOX были сделаны в дистиллированной воде, чтобы поддерживать концентрацию DMSO ниже 0,01%. В ходе экспериментов антибиотики для клеточных культур не использовались.
Подсчет клеток и анализ содержания ДНК
Для подсчета клеток с использованием анализа исключения трипанового синего клетки MCF-7, MDA-MB-231 или MCF10A высевали в количестве 6000 клеток/см 2 на лунку 6-луночного планшета. Для клеток MCF10A их высевали в питательную среду без EGF. Подсчет клеток проводили с использованием 3 лунок 6-луночного планшета для технической репликации. Для анализа содержания ДНК с использованием анализа пролиферации клеток Cyquant (Invitrogen) клетки высевали по 2000 клеток на лунку и проводили с 8 техническими повторами в 96-луночном планшете. Засеянные клетки оставляли на 24 ч перед обработкой ДОКС или воздействием ИЭМП. ДНК, окрашенную Cyquant, измеряли при длине волны 480/520 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов Cytation 5 (BioTek).
Клоногенный анализ и количественная оценка колоний
Клоногенный анализ in vitro проводили с использованием окрашивания кристаллическим фиолетовым ( 24). Вкратце, клетки MCF-7 высевали либо по 100, либо по 1000 клеток на лунку 6-луночного планшета. Клетки обрабатывали DOX на 1, 4 и 7 день в RPMI с добавлением 10% FBS. С 1-го по 10-й день стимуляцию ИЭМП в дозе 3 мТл проводили в течение 1 ч. На 11-й день клетки промывали в PBS и окрашивали красителем кристаллическим фиолетовым, состоящим из 0,5% кристаллического фиолетового и 6% глутарового альдегида (Sigma Aldrich), в дистиллированной воде в течение 3 ч. Окрашенные колонии промывали 2 сменами водопроводной воды и оставляли сушиться. Изображения колоний были получены с использованием системы Chemidoc Imaging System (Bio-Rad) с настройкой фильтра Coomassie Blue Stain. Количество колоний и размер колоний на лунку оценивали с использованием опции анализа частиц ImageJ с использованием единицы измерения от 3 до 3500 пикселей с округлостью от 0,2 до 1. Средний фактор выживаемости (количество колоний) определяли как количество выживших клеток по отношению к количеству высеянных клеток и нормализовали к фактору выживания контрольной группы, выраженному как кратное изменение. Относительную частоту размера колонии определяли путем группирования колоний в несколько ячеек в соответствии с их относительным размером от самой маленькой до самой большой колонии после нормализации к общему количеству клеток.
Анализ активных форм кислорода с использованием DCH 2 FDA
Клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с черными лунками (Costar) с плотностью 5000 клеток на лунку с 7 повторами на условие и оставляли отстаиваться на 24 часа. Затем клетки обрабатывали DOX в концентрациях от 20 нМ до 50 мкМ в среде RPMI с добавлением 10% FBS в течение 16-18 часов. Клетки промывали теплым бесфенольным и бессывороточным (PFSF) RPMI (Gibco) и инкубировали с 10 мкМ DCH 2 FDA (Invitrogen) в PFSF RPMI. Затем клетки подвергали воздействию ИЭМП 0 мТл или 3 мТл в течение 30 минут с последующим отмыванием оставшегося внеклеточного красителя теплым PFSF RPMI и оставляли в стандартном инкубаторе на 30 минут перед тем, как приступить к определению АФК с помощью ридера микропланшетов Cytation 5 ( BioTek) при Ex/EM: 492/520 нм каждый час.
Определение внутриклеточного кальция
Клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с черными лунками с прозрачным дном (Costar) при плотности 5000 клеток на лунку с 7 повторами на условие и оставляли отстаиваться на 24 часа. Клетки обрабатывали DOX в концентрациях от 20 нМ до 50 мкМ в среде RPMI с добавлением 10% FBS в течение 16-18 часов. Затем клетки промывали раствором RPMI без фенола и сыворотки при комнатной температуре (PFSF) (Gibco) и инкубировали с 1 мкМ Calcium Green-1 AM (Invitrogen) в RPMI PFSF. Затем клетки немедленно подвергали воздействию ИЭМП 0 мТл или 3 мТл в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим отмыванием избытка внеклеточного красителя с использованием PFSF RPMI перед тем, как приступить к измерению флуоресценции кальция с использованием ридера микропланшетов Cytation 5 (BioTek) при Ex/ ЭМ: 506/531 нм после 25 мин инкубации при комнатной температуре.
Западный анализ
Клеточные лизаты готовили в охлажденном льдом буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA), содержащем 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и 50 мМ Tris (pH 8,0), дополненного протеазой (Nacalai Tesque) и ингибиторы фосфатазы (ФосфоСТОП, Рош). Клетки лизировали в течение 20 мин и центрифугировали в течение 10 мин при 13500 об/мин. Концентрацию белка в растворимых фракциях определяли с помощью реагента BCA (Thermo Fisher Scientific). 25-50 мкг общего белка разделяли с помощью электрофореза в 10% или 12% денатурирующем полиакриламидном геле и переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P, PVDF). Белки на мембранах PVDF блокировали с помощью 5% нежирного молока в TBST, содержащем 0,1% Tween-20, и инкубировали с первичными антителами в SuperBlock TBS (Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при 4°C. Используемые первичные антитела: TRPC1 (1: 300; Санта-Крус), циклин D1 (CD1, 1:300; Санта-Крус), GFP (1:1000; Proteintech), β-актин (1:10 000; Proteintech), α-тубулин (1:5000; Proteintech). Мембраны промывали в TBST. Антикроличье или антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), разводили (1:3000, Thermo Fisher Scientific) в 5% молоке в TBST и инкубировали с мембранами в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в хемилюминесцентном субстрате SuperSignal West Pico или West Femto (Thermo Fisher Scientific), детектировали и анализировали с помощью LI-COR Image Studio. Thermo Fisher Scientific) в 5% молоке в TBST и инкубировали с мембранами в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в хемилюминесцентном субстрате SuperSignal West Pico или West Femto (Thermo Fisher Scientific), детектировали и анализировали с помощью LI-COR Image Studio. Thermo Fisher Scientific) в 5% молоке в TBST и инкубировали с мембранами в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в хемилюминесцентном субстрате SuperSignal West Pico или West Femto (Thermo Fisher Scientific), детектировали и анализировали с помощью LI-COR Image Studio.
Лазерная конфокальная визуализация
Для визуализации содержания GFP и виментина в клетках MCF-7 со сверхэкспрессией TRPC1 клетки высевали на покровные стекла при плотности 100 000 клеток на лунку 6-луночного планшета (Nunc). Через 24 ч после посева клетки промывали PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 мин. Для прямой визуализации экспрессии GFP в клетках, содержащих только вектор, и клетках MCF-7/TRPC1 клетки с покровных стекол помещали на предметные стекла с использованием ProLong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Затем клетки анализировали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FV1000. Для визуализации виментина клетки пермеабилизировали 0,1% тритоном в PBS в течение 10 мин после фиксации. Затем клетки блокировали в SuperBlock TBS (Thermo Fisher Scientific) с последующей инкубацией в течение ночи с антителом к виментину (Santa Cruz, 1:100). затем вторичное антитело Alexa Fluor 594 (1:500, Thermo Fisher Scientific) в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывки между стадиями проводили PBS с 0,1% Tween (Sigma Aldrich). Ядра клеток совместно окрашивали DAPI (Sigma Aldrich) в течение 10 мин. Наконец, клетки монтировали и визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Для количественного анализа содержания виментина общую абсолютную интенсивность на просмотр нормализовали по количеству ядер, чтобы получить среднюю интенсивность белка на клетку. Среднее значение средней интенсивности белка на клетку (не менее 10 клеток на просмотр) из нескольких повторов использовали для вычисления и сравнения содержания белка виментина между клетками, содержащими только вектор, и клетками MCF-7/TRPC1. Промывки между стадиями проводили PBS с 0,1% Tween (Sigma Aldrich). Ядра клеток совместно окрашивали DAPI (Sigma Aldrich) в течение 10 мин. Наконец, клетки монтировали и визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Для количественного анализа содержания виментина общую абсолютную интенсивность на просмотр нормализовали по количеству ядер, чтобы получить среднюю интенсивность белка на клетку. Среднее значение средней интенсивности белка на клетку (не менее 10 клеток на просмотр) из нескольких повторов использовали для вычисления и сравнения содержания белка виментина между клетками, содержащими только вектор, и клетками MCF-7/TRPC1. Промывки между стадиями проводили PBS с 0,1% Tween (Sigma Aldrich). Ядра клеток совместно окрашивали DAPI (Sigma Aldrich) в течение 10 мин. Наконец, клетки монтировали и визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Для количественного анализа содержания виментина общую абсолютную интенсивность на просмотр нормализовали по количеству ядер, чтобы получить среднюю интенсивность белка на клетку. Среднее значение средней интенсивности белка на клетку (не менее 10 клеток на просмотр) из нескольких повторов использовали для вычисления и сравнения содержания белка виментина между клетками, содержащими только вектор, и клетками MCF-7/TRPC1. Для количественного анализа содержания виментина общую абсолютную интенсивность на просмотр нормализовали по количеству ядер, чтобы получить среднюю интенсивность белка на клетку. Среднее значение средней интенсивности белка на клетку (не менее 10 клеток на просмотр) из нескольких повторов использовали для вычисления и сравнения содержания белка виментина между клетками, содержащими только вектор, и клетками MCF-7/TRPC1. Для количественного анализа содержания виментина общую абсолютную интенсивность на просмотр нормализовали по количеству ядер, чтобы получить среднюю интенсивность белка на клетку. Среднее значение средней интенсивности белка на клетку (не менее 10 клеток на просмотр) из нескольких повторов использовали для вычисления и сравнения содержания белка виментина между клетками, содержащими только вектор, и клетками MCF-7/TRPC1.
КПЦР в реальном времени и молчание TRPC1
Количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-qPCR) проводили с использованием рабочего процесса обнаружения на основе SYBR green. Вкратце, общую РНК собирали из клеток MCF-7 с использованием реагента Trizol (Thermo Fisher Scientific) и 0,5 мкг РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad). Количественную оценку экспрессии транскриптов генов проводили с использованием SSoAdvanced Universal SYBR Green (Bio-Rad) на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Touch (Bio-Rad). Относительную экспрессию транскрипта определяли с использованием метода 2- ΔΔCt , нормированного на уровни транскрипта β-актина. Используемые праймеры для количественной ПЦР представляли собой: TRPC1 , F: 5′-AAG CTT TTC TTG CTG GCG TG, R: 5′-ATC TGC AGA CTG ACA ACC GT; УЛИТКА, F: 5′-CGA GTG GTT CTT CTG CGC TA, R: 5′-CTG CTG GAA GGT AAA CTC TGG A; SLUG , F: 5′-TAG AAC TCA CAC GGG GGA GAA G, R: 5′-ATT GCG TCA CTC AGT GTG CT; ВИМЕНТИН F: 5′-AAG GCG AGG AGA GCA GGA TT, R: 5′-AGG TCA TCG TGA TGC TGA GA; и β-ACTIN , 5′-AGA AGA TGA CCC AGA TCA TGT TTG A, R: 5′-AGC ACA GCC TGG ATA GCA AC.
Для молчания TRPC1 в клетках MCF-7 использовали две предварительно сконструированные короткие интерферирующие РНК дайсер-субстрата (dsiRNA, IDT), чтобы сбить экспрессию TRPC1. Обе dsiRNA нацелены на кодирующую последовательность TRPC1 ( NM_001251845 ). Трансфекцию дсиРНК проводили с использованием реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Клетки, заглушенные TRPC1, проверяли с помощью количественной ПЦР через 48 ч после трансфекции дсиРНК с использованием праймеров против TPRC1 , SNAIL, SLUG и VIMENTIN , как указано выше, относительно клеток, трансфицированных скремблированной дсиРНК.
Анализ миграции
Клетки MCF-7 с плотностью 30000 клеток в 120 мкл RPMI с добавлением 10% FBS высевали в каждый квадрант 4-луночной вставки для культуральной чашки диаметром 3,5 мм (там же). Клетки оставляли для прилипания на 24 часа перед удалением вставки и добавлением среды RPMI, содержащей 10% FBS, до общего объема 2 мл на чашку. Закрытие промежутков фиксировали с помощью световой микроскопии на всех четырех концах вставки каждые 24 часа. Учитывали среднее значение 16 расстояний от 4 конечностей с 4 показаниями от каждой конечности. Изображения расстояний зазора были проанализированы с помощью ImageJ.
Анализ вторжения
Анализ инвазии проводили с использованием 24-луночного набора CytoSelect для анализа инвазии клеток (Cell Biolabs, Inc.) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, 200000 клеток высевали во вставку для клеточных культур после регидратации базальной мембраны в среде RPMI, не содержащей FBS. Нижняя лунка планшета для инвазии была заполнена средой RPMI с добавлением 10% для стимуляции инвазии клеток через базальную мембрану. 20 нг/мл TGFβ добавляли в выбранных условиях во вставку для клеточной культуры, чтобы стимулировать инвазию клеток. Установку инкубировали в течение 48 ч в стандартном инкубаторе для тканевых культур перед выделением и окрашиванием инвазированных клеток из базальной мембраны. Лизаты из выделенных клеток анализировали при ОП 560 с использованием ридера микропланшетов Cytation 5 (BioTek).
Создание плазмиды и стабильной клеточной линии
Плазмида GFP-TRPC1 была получена путем ПЦР-амплификации полноразмерной кДНК TRPC1 человека (регистрационный номер: NM_001251845.2 ; 2382 пары оснований) и направленно субклонирована в вектор pEGFP-C1. Трансфекцию плазмид в клетки MCF-7 осуществляли с использованием реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Через 48 ч после плазмидной трансфекции стабильные клетки отбирали в среде RPMI, содержащей 750 мкг/мл генетицина (Invitrogen), 10% FBS и 1% Pen/Strep (Gibco) в 5% CO2 .при 37°С. Вектор GFP и клетки GFP-TRPC1 обогащали GFP-положительными клетками с использованием сортировщика клеток Beckman Coulter Moflo Astrios. Затем стабильные клетки поддерживали в полной среде RPMI, содержащей 500 мкг/мл генетицина. Сверхэкспрессию GFP-TRPC1 в стабильных клетках характеризовали с помощью количественной ПЦР, иммунофлуоресценции и вестерн-анализа. Стабильные клетки GFP называются клетками только для вектора, в то время как стабильные клетки со сверхэкспрессией GFP-TRPC1 в рукописи называются клетками MCF-7/TRPC1.
Апоптотический анализ
Для определения апоптотических клеток опухоли диссоциировали на отдельные клетки с использованием набора для диссоциации опухолей MACS в сочетании с диссоциатором softMACS (Miltenyi Biotec) в соответствии с протоколом производителя. После диссоциации клетки фильтровали через 30 мкм MACS SmartStrainer. Клетки осаждали из фильтрата при 300 г x 7 мин и ресуспендировали в 400 мкл буфера для связывания. Клетки инкубировали с аннексином V FITC и йодидом пропидия (Sigma Aldrich) в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. После инкубации клетки осаждали и ресуспендировали в 100 мкл связывающего буфера для анализа методом проточной цитометрии с использованием цитометра BD Accuri C6 (BD Biosciences, Калифорния, США).
Парадигмы воздействия PEMF
Основное устройство PEMF и магнитный сигнал, используемые в этом исследовании, были описаны ранее ( 10 ). Катушка для молочной железы, протестированная и дебютировавшая в этом исследовании, генерирует тот же сигнал, что и ранее использовавшаяся для лечения рака молочной железы ( 10 ), и основана на классической конфигурации катушки Гельмгольца, оптимизированной для однородности поля в пределах размеров 120 мм в высоту и 75 мм в радиусе ( дополнительное Рисунки 1А- С ) . Размеры катушки были получены из существующих катушек для сканирования молочной железы при клинической МРТ. Катушка размещается в стандартной кровати пациента, чтобы обеспечить удобное положение пациентов в течение всего сеанса воздействия ( дополнительный рисунок 1D ).
Система грудных катушек была изготовлена по контракту компанией Flex Ltd. (Сингапур) в соответствии с нашими спецификациями и состоит из модуля аппликатора поля (катушки, генерирующей поле) и модуля усилителя мощности. Запатентованная конфигурация катушки была унифицирована для оптимальной генерации сигнала в полевом аппликаторе. Процесс прецизионной намотки проволоки обеспечил генерацию однородного электромагнитного сигнала в объеме аппликатора поля, как описано ранее ( 10 ).
Модуль усилителя поддерживает требования к питанию полевого аппликатора для создания заданных импульсных электромагнитных полей с использованием встроенного программного обеспечения, точно настроенного с минимальным тепловыделением, гарантируя, что различные характеристики выходного сигнала находятся в пределах определенных допусков. Модуль контроля безопасности потребления энергии и тока предназначен для контроля потребления тока полевым аппликатором в режиме реального времени с механизмом обратной связи с микроконтроллером. Система позволяет активно прерывать лечение в случае превышения тока или чрезмерного воздействия поля на субъекта, использующего устройство. Биологическая эффективность системы была подтверждена в подмножестве экспериментов на клетках и животных, проведенных в этой рукописи ( дополнительные рисунки 1A — C ).
Статистический анализ
Вся статистика проводилась с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 9). Если не указано иное, статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для сравнения значений между двумя или более группами с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Для сравнения двух независимых выборок применяли критерий Стьюдента .
Результаты
PEMF и лечение доксорубицином действуют синергетически, замедляя рост опухоли рака молочной железы in vivo
Ранее было показано, что воздействие PEMF ухудшает жизнеспособность клеток рака молочной железы MCF-7 при введении с амплитудой 3 мТл в течение 1 часа в день ( 10 ). Здесь мы показываем, что аналогичное воздействие PEMF на мышей NSG с ослабленным иммунитетом, принимающих ксенотрансплантаты опухоли молочной железы (PDX), полученные от пациентов, показало регрессию роста опухоли молочной железы. Привитым человеческим опухолям давали возможность расти у мышей в течение 3 недель перед еженедельным воздействием 3 мТ PEMF в течение 1 часа в неделю и/или внутривенным введением 20 мг/кг DOX. Через 5 недель опухоли собирали и анализировали (Рисунок 1А). Нелеченные (контрольные) опухоли показали прогрессивное увеличение объема примерно на 90% от их исходных значений (Рисунок 1Б; красный). Напротив, лечение только ИЭМП значительно уменьшало объем опухоли примерно на -20% (Рисунок 1Б; синий) и введение доксорубицина (DOX) уменьшало объем опухоли примерно на -50% (Рисунок 1Б; коричневый) по сравнению с начальными значениями. Более того, частота апоптотических клеток увеличилась на +1,61%, +8,8% и +17,9% в опухолях, выделенных из контрольной группы, мышей, подвергшихся воздействию ИЭМП, и мышей, получавших ДОКС, соответственно.Фигуры 1С, Г). Синергизм между вмешательствами PEMF и DOX был выявлен с использованием двух парадигм: 1) воздействие PEMF один раз в неделю в течение 2 недель с последующим 3-недельным лечением только DOX и; 2) одновременное еженедельное лечение ИЭМП и ДОКС в течение 5 недель. Среди всех тестовых условий парадигма 1 (Рисунок 1Б, зеленый) вызвал наибольшее уменьшение объема опухоли (~-70%) и увеличение количества апоптотических клеток (~+45%) (Рисунок 1D, зеленый), при этом резорбция опухоли (Рисунок 1Б, зеленый) статистически отличался от лечения только DOX (коричневый), но не от парадигмы 2 (желтый). В печени мышей, получавших PEMF, а затем DOX (парадигма 1), не было выявлено значительных признаков коллатерального апоптоза.Рисунок 1D, черный), демонстрирующий цитотоксическую специфичность в отношении злокачественных тканей.
PEMF синергически с DOX ингибируют рост опухоли in vivo . (A) Схема режимов воздействия PEMF и DOX, используемых на мышах с ксенотрансплантатами опухолей, полученных от пациентов. Имплантированным опухолям давали расти в течение 3 недель перед началом лечения DOX (20 мг/кг) и/или PEMF. Объемы опухолей измеряли каждую неделю, а определение апоптотических клеток проводили в конце исследования. Каждая точка данных представляет собой средние значения из 5 экспериментальных циклов, полученные для опухолей, полученных от 5 пациентов, каждый из которых был поровну разделен между 5 группами лечения. (B) Изменения объема опухоли (мм 3 ) в течение 5 недель. (С)Репрезентативные точечные диаграммы рассеяния, показывающие клеточные популяции из диссоциированных опухолей на основе окрашивания аннексином V и йодидом пропидия. (D) Количественная оценка процентов апоптотических клеток, полученных с помощью проточной цитометрии. * р < 0,05, ** р < 0,01 и # р < 0,0001. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего.
Модель хориоаллантоисной мембраны цыпленка (CAM) использовалась для первоначального изучения механизмов, придающих раку молочной железы уязвимость к воздействию PEMF ( 25 ). Отсутствие иммунной системы и присутствие эстрогена и прогестерона во время раннего развития цыплят ( 26 , 27 ) делают модель САМ идеальным хозяином для пересадки гормоночувствительных клеток, таких как клетки рака молочной железы MCF-7 ( 25 ). Опухоли, происходящие из MCF-7, имплантировали в 7-дневные яйца и давали им прижиться в течение 3 дней перед ежедневным воздействием 3 мТ PEMF в течение 1 часа в день в течение 4 дней подряд.Рисунок 2А). Куриные эмбрионы, побочно подвергавшиеся воздействию полей, не показали каких-либо межгрупповых различий в весе к моменту окончания исследования (Рисунок 2Б). С другой стороны, опухолевые ксенотрансплантаты, подвергшиеся воздействию ИЭМП 3 мТл, показали значительную потерю массы (~ 50%) по сравнению с необлученными (0 мТл) опухолями (Фигуры 2С, Г). Параллельно экспрессия белка канала TRPC1 была снижена примерно на 30% в опухолях, подвергшихся воздействию PEMF.Рисунок 2Е), тогда как уровни циклина D1 были незначительно затронуты (Рисунок 2F), предполагая, что апоптоз, а не замедление клеточной пролиферации, является преобладающим эффектом, вызываемым воздействием магнитного поля. Комбинация методов лечения (3 мТ + DOX) снижала массу опухоли примерно на 57% по сравнению с контролем (0 мТ + физиологический раствор) по сравнению с примерно 36%, наблюдаемыми при применении только DOX (Фигуры 2Г, Н), подтверждая ранее наблюдаемый синергизм (Рисунки 1Б, Г). Комбинированное лечение 3 mT и DOX также снижало экспрессию канала TRPC1 примерно на 40% (Рисунок 2I) и экспрессия белка Cyclin D1 до ~ 50%, хотя и незначительно (Рисунок 2J), контрольных значений (0 мТ + физиологический раствор). Окрашивание TUNEL опухолей MCF-7 CAM, обработанных PEMF и DOX, показало более высокие уровни фрагментации ДНК, чем обработка только DOX или контроль (Цифры 2К, Л). Окрашивание TUNEL, проведенное на печени куриных эмбрионов после различных обработок, не выявило существенных изменений в количестве клеток, демонстрирующих апоптозную фрагментацию ДНК.Рисунок 2М), подтверждая, что парадигма PEMF специфически повреждает раковые клетки, а не коллатеральные ткани.
PEMF ингибирует рост опухоли молочной железы in vivo , что коррелирует со сниженным уровнем экспрессии TRPC1. (A) Схема парадигмы воздействия PEMF, используемой на модели CAM для ксенотрансплантатов опухоли молочной железы MCF-7. Опухоли MCF-7 инокулировали на САМ на 7-й день. Опухоли либо подвергали воздействию 3 мТл в течение 1 ч в течение 4 последовательных дней, либо подвергали воздействию 3 мТл через 1 ч обработки DOX (0,04 мкг/г) начиная с 10-го дня. (B) Вес эмбриона цыпленка в конце исследования на 14-й день для обеих групп. (C) Репрезентативные изображения размера опухоли MCF-7 на 14-й день и соответствующая количественная оценка (D) , представленная как кратное изменение при 0 мТл. TRPC1 (E) и циклин D1 (F)уровни экспрессии, нормализованные к GAPDH, соответственно, выраженные как кратное изменение при 0 мТл. (G) Репрезентативные изображения, показывающие размер опухоли MCF-7 после лечения в указанных условиях. Объединенные данные о массе опухоли (H) , выраженные в виде кратного изменения при 0 мТл. Уровни экспрессии белков TRPC1 (I) и Cyclin D1 (J) нормализованы по отношению к GAPDH и выражены как кратное изменение при 0 мТл. Измерения проводились как минимум в трехкратной повторности, минимум из 6 независимых яиц; * p < 0,05 и ** p < 0,01 или как указано. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. (K) Репрезентативное окрашивание TUNEL изолированных опухолей MCF-7 CAM (n = 4 на группу) и соответствующие графики скрипки(L) интенсивности флуоресценции TUNEL. Два среза на опухоль анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста множественных сравнений Сидака; ** р < 0,01 и # р < 0,0001. (M) Репрезентативные микрофотографии печени 5 цыплят в группе, показывающие окрашивание TUNEL в указанных условиях. Масштабная линейка = 100 мкм. Положительные контроли TUNEL срезов опухоли и печени MCF-7 обрабатывали ДНКазой перед окрашиванием TUNEL. Ядра окрашивали DAPI (синий). «ns» указывает на статистически незначимые различия.
Лечение PEMF и DOX ухудшает выживаемость клеток рака молочной железы человека in vitro и ex vivo
Подтверждая предыдущие выводы ( 10 ), воздействие ИЭМП (Рисунок 3А) уменьшил количество жизнеспособных MCF-7 (~22%;Рисунок 3Б) и МДА-МБ-231 (~32%;Рисунок 3С) клетки рака молочной железы, тогда как нормальные клетки молочной железы MCF10A были нечувствительны к той же парадигме воздействия (Рисунок 3D). Примечательно, что более сильное воздействие PEMF (5 мТл) было неэффективным для уничтожения клеток рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-231.Фигуры 3В–Д). Клоногенный анализ был использован для определения in vitro долгосрочных эффектов воздействия магнитного поля на клетки рака молочной железы ( 24 ), в результате чего клетки MCF-7 были высеяны с клональной плотностью и подвергнуты воздействию ИЭМП мощностью 3 мТл в течение 10 последовательных дней ( 24).Рисунок 3Е). Номер колонии (Рисунок 3F) и размер (Рисунок 3G) были снижены при воздействии PEMF (синий) по сравнению с культурами, не подвергавшимися воздействию (0 мТл; красный), что согласуется с замедлением пролиферации MCF-7 в ответ на воздействие PEMF (Рисунок 3Б). Кроме того, ex vivo исследование биоптатов опухоли молочной железы человека показало усиление окрашивания TUNEL после однократного воздействия ИЭМП в течение 1 часа без каких-либо значительных изменений в здоровых тканях молочной железы (Рисунок 3Н), что указывает на уязвимость опухолей молочной железы к воздействию ИЭМП.
Воздействие PEMF подавляет рост раковых клеток in vitro и ex vivo (человек). (A) Схема графика воздействия PEMF для количественной оценки живых клеток. Подсчет живых клеток с использованием анализа исключения трипанового синего для клеток MCF-7 (B) , MDA-MB-231 (C) и MCF10A (D) . Клетки подвергали воздействию 0 мТ, 3 мТ или 5 мТ PEMF в течение 1 ч каждый день в течение 3 дней подряд перед количественной оценкой клеток с # p <0,0001. (Э)Схема режима формирования клональных колоний MCF-7. Воздействие ИЭМП проводилось при 3 мТл в течение 1 ч/сут. Репрезентативные изображения колоний клеток MCF-7, образованных с воздействием PEMF и без него (слева), и соответствующая количественная оценка выживших колоний, показанная как кратное изменение при 0 мТл (справа). (G) Увеличенные изображения колоний MCF-7, образованных с (3 мТл) и без (0 мТл) воздействием PEMF (слева), и соответствующие частотные распределения размеров колоний, нормализованные к общему количеству колоний (справа). Клетки высевали с плотностью 100 на лунку. Данные получены от 3 до 6 независимых биологических повторов с * p <0,05. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. ( Ч, слева) TUNEL-окрашивание (зеленый) парных биопсий опухолей молочной железы или здоровых тканей молочной железы через 24 часа после воздействия 3 мТл PEMF или в состоянии без воздействия (0 мТл). Ядра окрашивали DAPI (синий). Масштабная линейка = 100 мкм. ( H , справа ) Соответствующий линейный график, показывающий изменения в окрашивании TUNEL между парными образцами, подвергнутыми воздействию ИЭМП 0 мТл или 3 мТл на площадь ткани. Каждая линия представляет одну независимую выборку пациентов, разделенную на две части для независимого лечения и сравниваемую с использованием одностороннего парного t — критерия. Врезной график представляет собой объединенное среднее значение того же анализа TUNEL после нормализации 3 мТл/0 мТл каждого отдельного образца, выраженное как кратное изменение по сравнению с 0 мТл. Анализ проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Сидака, где * p< 0,05, а планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего значения. «ns» указывает на статистически незначимые различия.
Затем был исследован синергизм in vitro между обработками PEMF и DOX. Количество клеток оценивали в ответ на воздействие PEMF в течение 3 дней подряд (1 час в день) с одновременным введением DOX на третий день (Рисунок 4А) при заявленной IC 50 для клеток MCF-7 (100 нМ) ( 28 ). Одно только воздействие PEMF снижало содержание клеточной ДНК примерно на 20% (Рисунок 4Б; сплошной синий), в то время как обработка только DOX снижала содержание ДНК примерно на 30% (Рисунок 4Б; заштриховано красным) по сравнению с необлученными контрольными культурами (Рисунок 4Б; 0 мТл, сплошной красный). Прекондиционирование клеток MCF-7 двухдневным воздействием ИЭМП усиливало ДОКС-цитотоксичность примерно на 45% (Рисунок 4Б; заштрихованы синим), резюмируя сценарии in vivo (фигура 1; зеленый иРисунок 2Н). Последствия воздействия PEMF во время длительного лечения DOX были затем установлены с помощью клоногенной системы путем снижения концентрации DOX до 10 нМ (10-кратное) или 20 нМ (5-кратное). Культурам MCF-7 вводили DOX в дни 1, 4 и 7 в сочетании с ежедневным воздействием PEMF в течение 10 дней.Рисунок 4С). Номер колонии (Фигуры 4Г, Д) и размер (Фигуры 4F, G) заметно снижались в ответ на DOX в культурах с низкой и высокой плотностью соответственно при любой дозе. Индивидуально DOX (10 нМ) (Рисунок 4D; вверху, в середине) и PEMF (Рисунок 4D; внизу слева) обработка уменьшила количество колоний MCF-7 примерно на 30% (Рисунок 4Е; заштрихованы красным) и ~10% (Рисунок 4Е; сплошной синий) соответственно, тогда как комбинация DOX (10 нМ) и воздействия PEMF (Рисунок 4D; внизу, в середине) уменьшил количество колоний на 40% (Рисунок 4Е; заштрихованы синим цветом), по сравнению с необлученными культурами 0 мТл (Рисунок 4D; сверху, слева иРисунок 4Е; сплошной красный). Комбинация DOX (20 нМ) и воздействия PEMF (Рисунок 4G; заштрихованы синим цветом) вызывал общий сдвиг в сторону более мелких колоний, увеличивая и уменьшая количество самых маленьких и самых больших колоний, соответственно, по сравнению с обработкой только DOX (Рисунок 4G; красная штриховка). Следовательно, лечение PEMF и DOX синергизирует in vitro , замедляя рост клеток рака молочной железы.
Воздействие PEMF повышает уязвимость клеток MCF-7 к доксорубицину. (A) Схема режима обработки PEMF и DOX для количественного определения ДНК. Клетки подвергали воздействию 3 мТл в течение 1 ч ежедневно в течение 3 дней подряд. DOX (100 нМ) вводили в последний день за 1 час до последнего воздействия PEMF. Содержание клеточной ДНК измеряли через 24 ч после последнего воздействия ИЭМП. (B) Количественная оценка объединенных данных по содержанию клеточной ДНК, представленная как кратное изменение через 24 часа после обработки DOX и PEMF. (C) Парадигма образования колоний для клеток MCF-7, обработанных DOX и PEMF. (D) Образование колонии MCF-7 в присутствии 10 и 20 нМ DOX, с воздействием PEMF и без него, как указано. Клетки высевали с плотностью 100 на лунку. (Э)Выживание колонии в 10 нМ DOX в условиях низкой плотности. Выживаемость колоний в присутствии 20 нМ DOX была слишком низкой для точного количественного определения. (F) Образование колонии MCF-7 в присутствии 10 и 20 нМ DOX, с воздействием PEMF и без него в условиях посева с высокой плотностью 1000 клеток на лунку. ( F , ниже) Увеличенные изображения клеток в парадигме лечения DOX. (G) Частотное распределение размера колонии в присутствии 20 нМ DOX и воздействия 0 мТ или 3 мТ, обозначенное красными и синими заштрихованными полосами соответственно; культуры высокой плотности. (ЧАС)Абсолютная интенсивность флуоресценции кальция клеток MCF-7, обработанных 16-часовым DOX при 20 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ и 50 мкМ. Клетки загружали Calcium Green-1 и подвергали воздействию ИЭМП в течение 30 минут перед промывкой, а через 25 минут определяли флуоресценцию. (I) Абсолютная флуоресценция DCH 2 FDA-ROS клеток MCF-7. Клетки аналогичным образом обрабатывали DOX (20 нМ, 100 нМ, 1 мкМ, 10 мкМ и 50 мкМ) в течение 16 ч перед одновременной инкубацией в DCH 2 FDA и воздействием ИЭМП в течение 30 мин. Измерение АФК проводили каждый час, и данные были представлены с 4 -го часа. Значения кальция и АФК представляют собой среднее значение 7 технических повторностей для каждого условия. Все полученные данные были от 3 до 5 независимых экспериментов, с * p< 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001 и # р < 0,0001. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. «ns» указывает на статистически незначимые различия.
Воздействие PEMF стимулирует выработку АФК в раковых ( 29 , 30 ) и нераковых ( 5 , 31 , 32 ) клетках. В основе этого ответа лежит магниточувствительный, TRPC1-опосредованный путь поступления кальция, который модулирует митохондриальное дыхание и пролиферацию клеток ( 5 , 32 ). Напротив, DOX увеличивает цитоплазматические и митохондриальные АФК, нарушая окислительно-восстановительный цикл и функцию митохондрий ( 33 ). Изменения в цитоплазматическом кальции измеряли в клетках MCF-7 для концентраций DOX в диапазоне от 20 нМ до 50 мкМ, с (Рисунок 4Н; синий) и без (Рисунок 4Н; красный) воздействие ИЭМП. Воздействие PEMF (синий) постоянно увеличивал цитоплазматический кальций по сравнению с исходным уровнем (красный) и дополнительно увеличивался с увеличением концентрации DOX, достигая максимума при 1 мкМ, а затем уменьшаясь при 50 мкМ, что, вероятно, отражает повышение цитотоксичности при более высоком уровне DOX. Аналогично, воздействие ИЭМП на клетки MCF-7 (Рисунок 4I; синий) постоянно увеличивал уровни АФК по сравнению с исходным уровнем (0 мТл, красный) при всех концентрациях DOX. Кроме того, базальный кальций (Рисунок 4Н; красный) и АФК (Рисунок 4I; красный) уровни были увеличены по сравнению с исходным уровнем (0 нМ DOX) при 10 мкМ и 100 нМ DOX соответственно, обеспечивая механистическую основу для потенциального синергизма между двумя видами лечения. Следовательно, лечение PEMF и DOX может синергизировать, повышая уровни цитоплазматического кальция и ROS в клетках MCF-7, что согласуется с участием TRPC1, который, как было показано, соответствует статусу злокачественности MCF-7 ( 5 , 34 ).
Лечение PEMF и DOX нацелено на клетки рака молочной железы, демонстрирующие повышенные уровни TRPC1
Экспрессия канала TRPC1 была снижена в опухолях MCF-7 CAM, подвергшихся воздействию DOX и PEMF, по отдельности или в комбинации.Рисунок 2I). Чтобы получить представление о механизме этого ответа, модуляция экспрессии TRPC1 in vitro была исследована после хронического воздействия PEMF и / или DOX и восстановления, а также в различных клеточных линиях рака молочной железы.Рисунок 5А). Лечение только хронического DOX (Рисунок 5Б; заштриховано красным) снизило экспрессию белка TRPC1 примерно на 50% от контрольного уровня (заштриховано красным) и дополнительно снизилось еще на ~10% (заштриховано синим цветом) в сочетании с ежедневным воздействием PEMF. Напротив, воздействие только PEMF не способно значительно снизить экспрессию TRPC1 (сплошной синий). Более того, рост при хронической и прогрессирующей обработке DOX (≤ 96 нМ) продуцировал DOX-резистентную клеточную линию MCF-7 (MCF-7/ADR) ( 28 ), которая демонстрировала ослабленную экспрессию TRPC1 (~-40%) (Рисунок 5С; серый) и пролиферация (~-90%) (Рисунок 5D; серый). Клетки MCF-7/ADR, серийно пассированные (> 5 раз) в отсутствие DOX, частично восстанавливали экспрессию TRPC1 , а также способность к пролиферации (Рисунок 5D, желтый). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими, что при хроническом воздействии DOX образуются устойчивые к DOX клетки MCF-7 ( 28 ). Таким образом, хроническое воздействие DOX при заданной IC50 нативных клеток MCF-7 способно к отбору против клеток рака молочной железы с врожденно повышенной экспрессией TRPC1 с образованием клеточного потомства с пониженной экспрессией TRPC1, пролиферативной способностью и химиочувствительностью. Таким образом, выявлена взаимосвязь между чувствительностью к DOX и уровнями экспрессии TRPC1, которая согласовывает предыдущие данные, показывающие, что DOX нацелен на пролиферирующие клетки MCF7 ( 35 ), фенотип, который зависит от экспрессии TRPC1 ( 5 , 34 ). Наконец, MDA-MB-231 (Рисунок 5Е, оранжевый) проявляли большую экспрессию TRPC1, чем клетки MCF-7 (Рисунок 5Е, красный) в соответствии с их повышенной уязвимостью к воздействию ИЭМП, проявляющейся в 68% (+/- 4%, стандартная ошибка среднего) и 78% (+/- 3%, стандартная ошибка) выживаемости после воздействия ИЭМП соответственно (Фигуры 3С против 3Б).
Химиорезистентность к DOX связана с подавлением канала TRPC1. (A) Режим PEMF (черные стрелки, 3 мТл) и DOX (красная стрелка, 20 нМ), используемый для анализа белка TRPC1. (B) Репрезентативный вестерн-блоттинг, показывающий изменения в TRPC1 через 11 дней в указанных условиях и соответствующее количественное определение уровней белка TRPC1, нормализованных до неэкспонированного 0 мТл. Клетки, обработанные DOX, представлены заштрихованными полосами в сочетании с воздействием PEMF 0 мТл (красный) или 3 мТл (синий). (C) Вестерн-блот анализ уровней белка TRPC1 в клетках MCF-7/ADR (96 нМ DOX; серый) и 10-дневных клетках MCF-7, обработанных 20 нМ DOX (заштрихован красным), по сравнению с наивными клетками MCF-7 (красный) . Наивные клетки MCF-7 и MCF-7/ADR выращивали в культуре в течение 3 дней перед анализом белка. (Д)Сравнение роста клеток (через 72 ч после посева; слева) и уровней транскрипта TRPC1 (справа) между клетками MCF-7/ADR (96 нМ), MCF-7/ADR (0 нМ) и наивными клетками MCF-7. Клетки MCF-7/ADR (96 нМ) были созданы с использованием возрастающих уровней DOX до конечной концентрации 96 нМ (серый). Серийное пассирование клеток MCF7/ADR (96 нМ) в отсутствие DOX давало клетки MCF-7/ADR (0 нМ) (желтые). (E) Вестерн-анализ уровней белка TRPC1 в клетках доброкачественного (MCF10A) и злокачественного рака молочной железы (MCF-7 и MDA-MB-231) после 48 часов роста в стандартных условиях. На соответствующей гистограмме показаны объединенные данные по кратному изменению экспрессии TRPC1, нормализованной до MCF10A. Все представленные результаты были от 3 до 5 независимых экспериментов с * p < 0,05, ** p< 0,01, *** p < 0,001 и # p < 0,0001. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. «ns» указывает на статистически незначимые различия.
Сверхэкспрессия TRPC1 усиливает пролиферацию MCF-7 и EMT, но ослабляет миграционную способность
Были исследованы потенциальные механистические взаимодействия между экспрессией TRPC1, пролиферативной и миграционной способностью и эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT) ( 5 , 31 , 36-38 ) . С этой целью была создана клеточная линия MCF-7 (MCF-7/TRPC1) со сверхэкспрессией слитого белка GFP-TRPC1, которую сравнивали со стабильной клеточной линией, экспрессирующей только вектор GFP. Уровни слитого белка GFP-TRPC1 (Рисунок 6А), транскрипты TRPC1 (Рисунок 6Б) и флуоресцентное окрашивание TRPC1 (Рисунок 6С) были намного выше в клетках MCF-7/TRPC1. Клетки MCF-7/TRPC1 (Рисунок 6D; зеленый) также продемонстрировал усиленную пролиферацию (Рисунок 6D; черный) согласуется с большей экспрессией белка Cyclin D1 (Рисунок 6Е). С другой стороны, клетки MCF-7/TRPC1 мигрировали медленнее.Рисунок 6F; внизу), чем контрольные клетки переносчиков (Рисунок 6F; вверху), проявляющееся замедленным закрытием введенной щели (Рисунок 6G). Сверхэкспрессия TRPC1 также увеличивала экспрессию генов активаторов транскрипции EMT, участвующих в метастатическом репрограммировании ( 39 ), SLUG и SNAIL ( 39).Рисунок 6Н). В соответствии с опубликованными данными ( 39 ), активация SLUG была связана с повышением уровня ВИМЕНТИНА ( 39).Рисунок 6Н, стенограмма;Рисунок 6И, белок) и снижение Е-кадгерина (Рисунок 6Н, стенограмма;Рисунок 6J, белок). Эти результаты согласуются с предыдущими сообщениями о регуляции транскрипции E-Cadherin Slug и Snail ( 40 ) при раке молочной железы ( 41 , 42 ). Наоборот, замалчивание TRPC1 приводило к подавлению SLUG и VIMENTIN с соответствующим увеличением E-CADHERIN , в то время как уровни SNAIL оставались неизменными .Рисунок 6К). Сайленсинг TRPC1 с помощью dsiRNA в наивных клетках MCF-7 также снижал базальную пролиферацию.Рисунок 6L), подтверждая, что TRPC1 является модулятором пролиферации. Сумма этих данных свидетельствует об участии TRPC1 в метастатическом репрограммировании рака молочной железы.
Характеристика клеточной линии MCF-7 со сверхэкспрессией TRPC1. (A) Вестерн-анализ, показывающий сверхэкспрессию GFP-TRPC1 в клетках MCF-7, обнаруженную с использованием антитела против GFP. (B) Количественная оценка кратного изменения ΔΔCt уровней транскрипта TRPC1 в клетках MCF-7/TRPC1 (зеленый) и клетках, трансфицированных вектором (черный). (C) Флуоресцентные изображения, показывающие GFP и GFP-TRPC1 в векторе и клетках MCF-7/TRPC1 соответственно. Масштабная линейка = 10 мкм. (D) Подсчет живых клеток для клеток MCF-7/TRPC1 (зеленый) и клеток, трансфицированных вектором (черный), в течение 3 дней. (E) Вестерн-анализ, показывающий уровни белка Cyclin D1 через 24 часа после посева. (Ф)Репрезентативные изображения миграции клеток за 4 дня. Стабильные клетки высевали с плотностью 30 000 на лунку за сутки до удаления вставки для создания зазора 0,5 мм. (G) Разрыв, оставшийся в течение 4 дней после анализа миграции. (H) Уровни транскриптов TRPC1 , SLUG , SNAIL , VIMENTIN и E-CADHERIN в векторных (черные) и MCF-7/TRPC1 (зеленые) клетках. Репрезентативные конфокальные изображения вектора и клеток MCF-7/TRPC1, окрашенных на виментин (I) и E-кадгерин (J)наряду с соответствующими гистограммами средней интенсивности на ячейку. Абсолютную интенсивность флуоресценции нормализовали к общему количеству ядер на проекцию. Масштабная линейка = 10 мкм. (K) Уровни транскриптов для TRPC1 , SLUG , SNAIL , VIMENTIN и E-CADHERIN в скремблированных (заштриховано черным цветом) и клетках с молчанием TRPC1 (заштриховано зеленым цветом). (L) Пролиферация в течение 3 дней для клеток с молчанием TRPC1 по сравнению с клетками, трансфицированными скрембл-РНК. Сайленсинг TRPC1 был достигнут с использованием 2 независимых dsiRNA, а гистограммы показывают соответствующую количественную оценку объединенных данных. Все результаты были от 3 до 5 независимых экспериментов с *р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001 и # р < 0,0001. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего. «ns» указывает на статистически незначимые различия.
Воздействие PEMF замедляет миграцию и снижает инвазивность клеток рака молочной железы, сверхэкспрессирующих TRPC1
Воздействие PEMF (3 мТл) дополнительно замедляло миграцию клеток MCF-7/TRPC1 по сравнению с их необлученным (0 мТл) состоянием (Рисунки 7А, Б), тогда как миграционная способность векторных клеток не изменялась при воздействии PEMF (Фигуры 7А, С). Инвазивность была установлена путем изучения способности клеток разрушаться, проникать и пересекать вставку, покрытую базальной мембраной.Рисунок 7D). Клетки MCF-7/TRPC1 проявляли уровень инвазивности (Рисунок 7D; зеленый), сравнимый по величине с TGFβ-стимулированными контрольными клетками (серый), но превышающий таковой у нестимулированных векторных клеток (черный). Воздействие PEMF ослабляло инвазивную способность клеток MCF-7/TRPC1 (заштриховано зеленым), но не могло этого сделать для TGFβ-стимулированных векторных клеток (заштриховано серым цветом). Поскольку повышенная базальная инвазивность MCF-7/TRPC1 сопровождалась увеличением количества неинвазивных клеток на верхней стороне культуральной вставки (Рисунок 7Е), может существовать причинно-следственная связь между TRPC1-опосредованным усилением пролиферации (Рисунок 6D) и инвазивность. С другой стороны, открытие того, что воздействие PEMF снижает инвазивность за счет ослабления как пролиферации клеток, так и замедления миграционной способности, является клинически значимым. Согласившись с продемонстрированным ингибированием транскрипции E-кадгерина в ответ на повышение уровня SNAIL и SLUG (Фигуры 6Н, J), уровни белка E-кадгерина были снижены в клетках MCF-7/TRPC1 (Рисунок 7F). Однако уровни E-кадгерина не изменились при воздействии PEMF (Рисунок 7F), возможно, отражая компенсирующую комбинацию реверсии метастазирования и замедления миграции клеток, вызванного ИЭМП (Рисунки 7А, Б), восстанавливая уровни E-кадгерина ( 43 ).
Воздействие PEMF ослабляет миграцию и инвазию клеток MCF-7/TRPC1. (A) Фотографическое сравнение миграции клеток, трансфицированных вектором, и клеток MCF-7/TRPC1, подвергшихся воздействию ИЭМП 0 или 3 мТл. Клетки высевали с плотностью 30 000 на лунку и оставляли для отстаивания на 24 часа перед удалением вставки. Клетки подвергали воздействию ИЭМП в течение 1 ч на вторые, третьи и четвертые сутки. Динамика закрытия разрыва для (B) клеток MCF-7/TRPC1 (0 и 3 мТл) и (C) вектора (0 и 3 мТл), нормализованных к 1-му дню. (D)Количественная оценка окрашенных (вторгшихся) клеток, выраженная в виде кратности изменения по сравнению с векторными клетками. Окрашенные клетки соответствуют тем, которые успешно внедрились в базальную мембрану и присутствуют на нижней стороне мембраны через 48 часов. Необработанные векторные клетки служили эталоном инвазии базальных клеток (черные). Серые столбцы представляют векторные клетки, которые были обработаны TGFβ во время посева для стимуляции инвазии в сочетании с (заштрихованы) и без (заштрихованы) воздействием 3 мТ PEMF при посеве и через 24 часа. (E) Плотность клеток на верхней стороне вставки через 48 ч после посева. Клетки окрашивали и лизировали по той же схеме, что и для анализа инвазии. (Ф)Вестерн-анализ экспрессии белка Е-кадгерина в векторе и клетках MCF-7/TRPC1 с воздействием ИЭМП и без него в течение 3 дней подряд. Уровни белка Е-кадгерина показаны как кратность изменения по сравнению с 0 мТл векторных клеток. Все результаты представляли собой от 3 до 5 независимых экспериментов с ** p < 0,01, *** p < 0,001 и # p < 0,0001. Столбики погрешностей выражены как стандартная ошибка среднего. «ns» указывает на несущественные различия.
Сверхэкспрессия TRPC1 повышает уязвимость клеток рака молочной железы к DOX и PEMF
Учитывая сниженную экспрессию TRPC1 и индуцированную DOX-резистентность при хроническом воздействии DOX (Рисунки 5Б, С), мы исследовали, повысит ли принудительная экспрессия TRPC1 чувствительность к воздействию DOX и/или PEMF. Клетки MCF-7/TRPC1 подвергались воздействию DOX (10 или 20 нМ) в течение 4 дней, с или без воздействия PEMF в течение 3 дней (Рисунок 8А). Воздействие PEMF само по себе уменьшало рост клеток как MCF-7/TRPC1 (Рисунок 8В; зеленые, сплошные по сравнению с заштрихованными) и векторные (черные, сплошные по сравнению с заштрихованными) клетки. Примечательно, что 10 нМ DOX подавлял рост как MCF-7/TRPC1 (~30%), так и векторных клеток (~20%) без явного ответа на воздействие PEMF (Рисунок 8В). С другой стороны, 20 нМ DOX вызывал сильную депрессию пролиферации как клеток MCF-7/TRPC1 (~80%), так и клеток-векторов (~70%), которая значительно усиливалась при воздействии PEMF на MCF-7/TRPC1 (~85%). .
Сверхэкспрессия TRPC1 повышает чувствительность клеток MCF-7 к воздействию доксорубицина и PEMF. (A) Режим обработки PEMF и DOX для количественного определения клеточной ДНК MCF-7 / TRPC1. (B) Количественная оценка изменения укладки ДНК по сравнению с векторными клетками 0 мТ. Статистический анализ проводили с использованием двухвыборочного t — критерия. (C) Образование колонии через 10 дней в присутствии 0 нМ, 10 нМ или 20 нМ DOX без воздействия PEMF. Изображения колоний MCF-7 и соответствующих частотных распределений размеров колоний, нормализованных к общему количеству колоний в присутствии 10 нМ DOX для (D) вектора и (E) клеток MCF-7/TRPC1 или 20 нМ DOX для (F) вектора и (Г)Клетки MCF-7/TRPC1 при ежедневном воздействии ИЭМП. * p < 0,05, ** p < 0,01 и *** p < 0,001 указывают на статистическую разницу между соответствующими условиями 0 мТл и 3 мТл в одном и том же бине. (H) PEMF-модулированный рост клеток MCF-7 с молчанием TRPC1 через 48 ч после трансфекции дсиРНК. Клетки трансфицировали тремя независимыми дсиРНК (зеленые), включая скрембл-РНК (черные). Контрольные (нетрансфицированные) клетки MCF-7 подвергали воздействию ИЭМП 0 мТл (красный) или 3 мТл (синий). (I) Комбинированное воздействие PEMF и DOX (20 нМ) на пролиферацию TRPC1.-молчащие клетки. Клетки подвергали воздействию PEMF через 24 ч и 48 ч после трансфекции дсиРНК перед анализом содержания ДНК (заштрихованные столбцы). Данные для дсиРНК TRPC1 (зеленый и темно-зеленый) были объединены данными двух независимых дсиРНК TRPC1. Статистический анализ был проведен с использованием множественного непарного t -критерия для сравнения средних значений двух образцов в колониях одного и того же размера. Все эксперименты представляли собой от 3 до 5 независимых экспериментов с * p < 0,05, ** p < 0,01 и *** p < 0,001. «ns» указывает на статистически незначимые различия. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего.
Несмотря на то, что избыточная экспрессия TRPC1 сама по себе оказывает лишь незначительное влияние на образование колоний MCF-7 .Фигура 8С, левый столбец), сверхэкспрессия заметно повышала уязвимость MCF-7 как к 10 нМ (Фигура 8С, средний столбец) и 20 нМ DOX (Фигура 8С, правый столбец), что приводит к меньшему количеству колоний меньшего размера по сравнению с неэкспонированными векторными культурами (0 мТл). Изучение влияния воздействия ИЭМП на размер колонии для борьбы с переносчиками (Фигуры 8D, F) и MCF-7/TRPC1 (Фигуры 8Е, Г) клеток в присутствии 10 нМ (Фигуры 8Г, Д) и 20 нМ (Фигуры 8F, G) DOX показал, что сверхэкспрессия TRPC1 способствует синергизму между обработками, который был максимальным в присутствии 20 нМ DOX и проявлялся в виде более выраженных сдвигов в сторону меньших колоний. Напротив, клетки MCF-7, в которых TRPC1 был генетически подавлен (Рисунок 8Н; зеленый, dsiRNAs) демонстрировали сниженную пролиферацию и были нечувствительны к воздействию PEMF (заштрихованы зеленым), тогда как нетрансфицированные (синие) или клетки, трансфицированные скрембл-РНК (заштрихованные черным), демонстрировали типичную депрессию пролиферации в ответ на воздействие PEMF. Более того, противораковый синергизм PEMF и DOX (20 нМ) отсутствовал в клетках с замалчиванием TRPC1 (заштрихованные и заштрихованные темно-зеленые), но сохранялся в клетках, трансфицированных скрембл-РНК (Рисунок 8И; сплошной и заштрихованный серый). Эти результаты подтверждают, что уровень экспрессии канала TRPC1 придает синергетические возможности при лечении DOX и PEMF.
Обсуждение
Первоначальные результаты исследований in vitro указывали на способность пульсирующих магнитных полей блокировать рост рака молочной железы MCF-7, не повреждая незлокачественные клетки MCF-10 ( 10 ). Здесь эти более ранние результаты были подтверждены в модели CAM in vivo в качестве хозяина для опухолей, происходящих из MCF-7. В соответствии с нашими выводами in vitro (Рисунок 3) ( 10 ), аналогичное воздействие PEMF значительно уменьшило вес и размер опухоли (Рисунок 2D), связанный со щажением коллатеральных тканей (Рисунок 2М). Ex vivo исследование биопсии человека также продемонстрировало избирательную уязвимость опухолей молочной железы к воздействию ИЭМП, в то время как здоровые ткани молочной железы не подвергались такому же протоколу воздействия.Рисунок 3Н). Кроме того, было показано, что та же парадигма магнитного поля эффективно замедляет рост опухолей человеческого происхождения, трансплантированных в модель PDX-мыши.Рисунок 1Б), не затрагивая здоровые ткани (Рисунок 1D). Таким образом, изначально была продемонстрирована надежная специфичность нашей парадигмы магнитного поля для рака.
Синергизм между обработкой PEMF и DOX при замедлении роста опухоли рака молочной железы был продемонстрирован как на моделях CAM цыплят, так и на мышах PDX. In vitro синергизм между воздействием PEMF и введением DOX был продемонстрирован в острой и хронической парадигмах, демонстрируя усиление подавления пролиферации.Рисунок 4Б) и рост колонии (Рисунки 4D–G), по сравнению с любой обработкой отдельно. Индивидуальное лечение PEMF ( 5 ) и DOX ( 3 ) индуцировало увеличение цитозольного кальция и АФК, которые синергизировали при комбинировании. Кумулятивный окислительный стресс, вызванный комбинированным лечением PEMF и DOX, может суммироваться, чтобы создать достаточно критическую окислительную среду для замедления роста клеток рака молочной железы. Воздействие PEMF также синергично с пеметрекседом и цисплатином в острой парадигме, хотя с более низкой комбинированной эффективностью, чем с DOX ( дополнительная фигура 2A, B ).
У мышей NSG с опухолями молочной железы человека наибольшее уменьшение размера опухоли, полученной от пациента, совпало с наибольшим увеличением апоптоза и наблюдалось при предшествующей 3-недельной химиотерапии DOX 2-недельному воздействию PEMF. Мы также изучили влияние воздействия PEMF на клетки рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF-7, привитые мышам NSG, с использованием клинического прототипа устройства магнитного поля, предназначенного для возможного использования при раке молочной железы человека ( дополнительная фигура 1 ). Опухоли MDA-MB-231 от мышей NSG, подвергшихся воздействию ИЭМП один раз (3 мТл x 1) или дважды (3 мТл x 2), показали увеличение апоптоза на +11% и +34% по сравнению с исходным уровнем (0 мТл) соответственно ( дополнительные рисунки ). 3А, Б ). Печень, полученная от этих же мышей, не показала значительного увеличения апоптоза. Дополнительный рисунок 3C ). Ксенотрансплантаты MCF-7 также подвергались той же парадигме PEMF/DOX, которая ранее использовалась вфигура 1( Дополнительный рисунок 4А ). Опять же, обработка PEMF и DOX синергически усиливала цитотоксичность рака, достигая +26% и +33% апоптоза (ранний плюс поздний) для опухолей, подвергнутых парадигмам 1 (PEMF, затем DOX) и 2 (PEMF и DOX), соответственно ( дополнительная фигура 4B ). ), и были выше, чем при лечении только DOX (+15%) или PEMF (+8%), тогда как исходный уровень (0 мТл) демонстрировал незначительный апоптоз (+0,3%). Как и в испытании мышей PDX ( фигура 1), синергизм между обработкой DOX и PEMF был очевиден в подрыве роста рака in vivo , по-видимому, без вовлечения здоровых тканей. У людей магнитная терапия будет иметь то преимущество, что она может быть направлена на область тела, пораженную раком, для локального синергизма с системным введением DOX ( дополнительная фигура 1 ), что потенциально позволяет снизить химиотерапевтическую дозу и уменьшить тяжесть побочного цитотоксического DOX-TRPC. канальные взаимодействия, такие как доксорубицин-индуцированная кардиотоксичность ( 44 ).
Магнитный митогормезис при раке
Митогормезис относится к процессу развития, при котором низкие уровни АФК стимулируют митохондриальную адаптацию к выживанию, усиливая антиоксидантную защиту клетки, тогда как преувеличенные уровни окислительного стресса вместо этого подавляют существующую антиоксидантную защиту клетки, блокируя выживание ( 7 ). Было показано, что TRPC1 необходим и достаточен для придания митохондриальным ответам на магнитные поля, создавая возможность запуска нового процесса магнитного митогормезиса в клетках, экспрессирующих TRPC1 ( 5 , 11 ). Со ссылкой на это исследование было показано, что воздействие PEMF подрывает рост клеток MCF-7 и MDA-MB-231 (Рисунки 3Б, С) в корреляции с экспрессией TRPC1 (Рисунок 5Е), предположительно из-за чрезмерной стимуляции этой недавно выясненной кальциево-митохондриальной оси (Рисунок 4Н) ( 5 , 11 ). Ранее было показано, что магниточувствительность и нижележащие митохондриальные ответы коррелируют с онтогенетическими экспрессией и функцией TRPC1 ( 5 , 11 , 32 , 45 ), тогда как другие распространенные каналы TRP не демонстрируют такой сильной корреляции ( 5 , 32 , 45 ). Более того, генетическое молчание TRPM7 ( 5 ), наиболее сильно и повсеместно экспрессируемого из всех каналов TRP ( 18), не смог предотвратить магнитную чувствительность, тогда как генетическое молчание TRPC1 само по себе было способно свести на нет магнитную чувствительность. Наконец, селективной везикулярной доставки TRPC1 в клетки, генетически сконструированные так, чтобы они были дефицитными по экспрессии TRPC1, было достаточно для восстановления магнитного митогормезиса ( 5 , 11 ). Магнитная чувствительность, придаваемая TRPC1, и его отношение к митогорметическим механизмам выживания ( 5 , 11 , 32 ) делают его ценной мишенью для клинического использования при лечении рака ( 34 ).
Каналы TRPC при раке молочной железы
Различные классы каналов TRP широко вовлечены в развитие различных видов рака, в частности, TRPC1 в области рака молочной железы ( 19 , 36 , 37 , 46-48 ) . Здесь мы показываем, что сверхэкспрессия TRPC1 увеличивает пролиферацию MCF-7 и чувствительность к DOX, но снижает миграционную способность (Рисунки 6–8). Сходным образом сверхэкспрессия miR-146b, модулятора воспаления ( 49 ), усиливала пролиферацию и химиочувствительность клеток эпителиальной карциномы яичников к цисплатину и паклитакселу, одновременно снижая миграционную способность ( 50 ).). Следовательно, при провоспалительных состояниях, таких как вызванные сверхэкспрессией TRPC1 или miR-146b, пролиферативные способности и химиочувствительность некоторых видов рака увеличиваются, тогда как миграционные способности уменьшаются. Провокационно, эти дихотомические пролиферативные и миграционные реакции на воспалительные состояния могут представлять собой точку уязвимости, которую можно использовать в терапии на основе ИЭМП для снижения инвазивности клеток рака молочной железы. Воздействие PEMF ослабляет пролиферативную и миграционную способность клеток рака молочной железы в положительной корреляции с экспрессией канала TRPC1.Рисунки 5а также7), что согласуется с доказательствами того, что каталитическая активация TRPC6, также связанная с пролиферацией и воспалительными реакциями при раке молочной железы, ослабляет жизнеспособность и миграционную способность клеток рака молочной железы MDA-MB-231 ( 51 ). Оба исследования дополнительно продемонстрировали снижение инвазивности клеток рака молочной железы в ответ на активацию либо TRPC1 (воздействие PEMF) (Рисунок 7D) или TRPC6 (ингибирование фурина) ( 51 ). Более того, экспрессия канала TRPC1 выше в высокометастатической клеточной линии MDA-MB-231 по сравнению с менее инвазивной клеточной линией MCF-7.Рисунок 5Е) ( 52 ). Эти результаты демонстрируют ценность индукции воспалительных реакций, опосредованных TRPC, для целенаправленной цели ослабления инвазивности рака молочной железы и указывают на терапевтическую нишу для терапии на основе PEMF при лечении рака. Наши будущие исследования повлекут за собой изучение вклада других классов каналов TRPC в прогрессирование рака молочной железы, а также оценку их полезности для потенциального использования в рамках синергетической противораковой оси PEMF-DOX.
ЕМТ представляет собой многогранный процесс, посредством которого трансформированные клетки приобретают метастатические способности и устойчивость к апоптозу ( 40 , 53 ). Более высокая экспрессия TRPC1, обнаруженная в небольших гистологических опухолях молочной железы 1, по сравнению с более крупными опухолями 3 степени ( 19 ), связана с их большей склонностью к ЭМП ( 36 , 54 ). Соответственно, мы демонстрируем, что сверхэкспрессия TRPC1 в клетках MCF-7 повышала экспрессию SLUG , SNAIL и VIMENTIN и подавляла экспрессию E-кадгерина в (Фигуры 6Н–Дж), в соответствии с метастатической индукцией ( 39 ). И наоборот, замалчивание TRPC1 снижало экспрессию SLUG и VIMENTIN и активировало E-CADHERIN .Рисунок 6К). Повышение экспрессии TRPC1 часто встречается при раке молочной железы ( 19 , 36 , 38 ) и может предрасполагать пренеопластические клетки к ЕМТ, придавая более пролиферативный и инвазивный фенотип.Рисунок 9). Таким образом, способность терапии на основе PEMF уменьшать пролиферацию и инвазивность клеток рака молочной железы путем избирательного нацеливания на клетки с высокой экспрессией канала TRPC1 заслуживает дальнейшего изучения в клинических испытаниях на людях.
Схематическое изображение клеточных событий, модулированных сверхэкспрессией и молчанием TRPC1 в клетках рака молочной железы MCF-7. Было показано, что ЕМТ и инвазивность коррелируют с экспрессией TRPC1 в клетках рака молочной железы, что дает возможность для разработки синергической сопутствующей магнитной терапии и терапии доксорубицином, которые избирательно нацелены на TRPC1 для лечения классов рака, характеризующихся повышенной экспрессией TRPC1.
Существуют признаки цитотоксического синергизма между DOX и различными каналами TRPC ( 44 ). Воздействие PEMF стимулирует TRPC1-опосредованное вовлечение сигнальной оси кальцинейрин-NFAT, участвующей в митохондриальном гомеостазе ( 5 ). При некоторых видах рака гиперактивность TRPC1 ( 55 ) может подавлять NFAT-опосредованные митохондриальные гомеостатические механизмы ( 56 ), в конечном счете отбирая раковые клетки с изначально высокой экспрессией каналов TRPC. Отрицательная селекция DOX против раковых клеток с повышенной экспрессией TRPC1 может способствовать обычно описанному парадоксу химиотерапии ( 57 ).), характерные для выживших раковых клеток с повышенной химиорезистентностью. Соответственно, мы показали, что хроническое воздействие DOX на клетки MCF-7 ослабляет экспрессию TRPC1 (Рисунки 5Б, С) и продуцирует DOX-резистентные клетки, демонстрирующие замедленную пролиферацию (Рисунок 5D) и потерял чувствительность к воздействию PEMF ( дополнительная фигура 5 ). Аналогичным образом, генетическое молчание TRPC1 в клетках MCF-7 уменьшало пролиферацию. Фигуры 8Н, I) и исключенные ответы как на PEMF (Рисунок 8Н) и ДОКС (Рисунок 8И) лечение, предполагающее причинно-следственную связь DOX и PEMF с TRPC1. Серийное пассирование клеток MCF-7/ADR в отсутствие DOX в конечном итоге восстанавливало уровни транскриптов TRPC1.Рисунок 5D, справа), пролиферативная способность (Рисунок 5D, слева) и чувствительность к воздействию PEMF ( дополнительный рисунок 5 , слева). Однако повторное введение клеток MCF-7/ADR (96 нМ DOX) или MCF-7/ADR (0 нМ DOX) в высокие дозы DOX (100 нМ) предотвратило реакцию на воздействие PEMF ( дополнительная фигура 5 ; справа) . Хотя результаты, представленные в этом исследовании, внутренне непротиворечивы и обеспечивают начальное доказательство эффективности, необходимо лучше понять последствия взаимодействия между DOX-PEMF-TRPC1 в реальных клинических условиях. Клиническая разработка терапии на основе PEMF может в конечном итоге позволить снизить химиотерапевтическую нагрузку DOX, чтобы помочь предотвратить побочную цитотоксичность ( 3 ) и парадоксальные эффекты ( 57 ), связанные с высокими клиническими дозами DOX.
Выводы
TRPC1 является митогорметической детерминантой, управляющей клеточным воспалительным статусом и выживаемостью ( 5 , 6 , 11 ). Повышенная экспрессия TRPC1 определяет многочисленные типы рака ( 15 , 37 ). Мы демонстрируем, что уязвимость рака молочной железы к терапии PEMF и DOX положительно коррелирует с экспрессией TRPC1, а также с инвазивностью и ЕМТ.Рисунок 9), что придает им повышенный уровень специфичности в отношении рака, характерного для TRPC1. Важно отметить, что, поскольку многие виды рака существуют вблизи порога метаболической цитотоксичности, когда даже умеренного усиления клеточного метаболизма достаточно, чтобы вызвать нарушение гомеостатического равновесия ( 8 ), окислительный синергизм, демонстрируемый осью TRPC1-PEMF-DOX, может быть использован для селективной индукции рака. специфическая метаболическая катастрофа (фигура 2). Таким образом, представленная комбинированная терапевтическая стратегия может оказаться более селективной и безопасной, чем традиционные методы лечения, особенно для рака, характеризующегося повышенной экспрессией канала TRPC1. Наконец, учитывая продемонстрированную специфичность лечения ИЭМП в отношении экспрессии TRPC1, о которой сообщалось здесь и в других источниках ( 5 , 11 , 32 , 45 ), дополнение традиционной химиотерапии на основе DOX локализованным воздействием ИЭМП может служить методом предотвращения побочной токсичности ( 3 ) . а также парадоксальные эффекты ( 57), позволяя снизить дозу системно доставляемого химиотерапевтического препарата при сохранении уникального уровня специфичности для рака, связанного с TRPC1. Потенциальная ценность этой уникальной комбинации характеристик заслуживает дальнейшего изучения и клинической проверки.
Заявление о доступности данных
Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью/ дополнительный материал . Дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору.
Заявление об этике
Образцы пациентов были собраны на основании одобрения Наблюдательного совета Национальной группы здравоохранения (2014/01088). Пациенты/участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Наньянского технологического университета (NTU) (ARF-SBS/NIE-A0141AZ, A0250AZ, A0324 и A0321).
Вклад автора
YT, AF-O и NT задумали и разработали это исследование. YT, KC, CF и SR выполнили анализ клеточной пролиферации, АФК, РНК и белков. YT, CF, JLY и JNY создали и охарактеризовали стабильную клеточную линию MCF-7, сверхэкспрессирующую TRPC1. YT, CF, KC и SR выполняли анализы на образование колоний, миграцию и инвазию. RH и AK установили модель CAM. KC, SR, YT и CF выполнили клетки MCF-7 на модели CAM. CC представил клинические опухоли молочной железы человека. YY и WT выполнили гистологию клинических образцов и доклинической модели PDX с использованием опухолей молочной железы человека и клеточных линий. YT, KC, CF, SR, NT и AF-O собрали и проанализировали данные. JF разработал спираль для груди, которая использовалась в некоторых исследованиях. Компания JL руководила изготовлением катушки для груди совместно с контрактным производителем FLEX Ltd (Сингапур). YT и AF-O написали рукопись.
Финансирование
Эта работа поддерживается Lee Kong Chian MedTech Initiative, Сингапур (N-176-000-045-001), грантом SMART Ignition Grant (R-176-000-206-592) и Институтом инноваций и технологий в области здравоохранения, iHealthtech, по адресу: Национальный университет Сингапура. Стоимость публикации этой статьи финансируется кафедрой хирургии Медицинской школы Йонг Лу Лин Национального университета Сингапура.
Конфликт интересов
AF-O и JF являются изобретателями патента WO 2019/17863 A1 «Система и метод применения импульсных электромагнитных полей», а также являются участниками QuantumTx Pte. Ltd., которая занимается разработкой устройств электромагнитного поля для человека. JF работал в компании Fields at Work GmbH. JL в настоящее время является сотрудником QuantumTx Pte. ООО
Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Примечание издателя
Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.
Благодарности
Авторы выражают признательность Заку Го (iHealthtech, Национальный университет Сингапура) за дизайн иллюстрации модели животного вРисунок 1А, иллюстрация модели CAM вРисунок 2А, иллюстрация грудной катушки на дополнительных рисунках 1A — C и графическое резюме. Авторы также хотели бы поблагодарить Ки Чуа То (iHealthtech, Национальный университет Сингапура) за фотосъемку кровати пациента и катушки для груди на дополнительном рисунке 1D . Мы также хотели бы поблагодарить сотрудников лаборатории электромагнитных импульсных систем Biolonic Currents (BICEPS) за их помощь, без которой это исследование было бы невозможным.
Дополнительный материал
Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.783803/full#supplementary-material .
Нажмите здесь, чтобы просмотреть файл с дополнительными данными. (2.8M, док)
использованная литература
46.Брюс Джи, Джеймс А.Д. Ориентация на сигнальный механизм кальция при раке . Раки (Базель) (2020) 12 ( 9 ): 2351. doi: 10.3390/cancers12092351 [ бесплатная статья PMC ] [ PubMed ] [ CrossRef ] [ Google Scholar ]
